利用基于金属有机框架的蛋白质提取方法，通过液相色谱-质谱（LC-MS）对冷冻小鼠肺组织进行跨膜蛋白质组分析

《Journal of Chromatography A》：Transmembrane proteome analysis of frozen mouse lung tissues by LC-MS using metal organic framework-based protein extraction

本研究开发了一种基于ZIF-67的金属有机框架辅助生物分离策略，优化了酶解和材料比例，显著提高了冷冻组织中多跨膜域膜蛋白的富集效率，为肺癌结节分型提供了新的分析方法。

　　

李珠|苗国|应佳刘|卢张|孙涛李|贾琪赵|建正朱|梅慧桑|励强钱|严张|华晓

上海交通大学药学院药物靶点发现与递送前沿科学中心，上海，200240，中国

摘要

膜蛋白（MPs）在细胞功能中起着关键作用，是药物发现和癌症研究的重要靶点。然而，由于它们的溶解度低、疏水性高和丰度低，MPs在分析上存在重大挑战，尤其是在溶解、分离和表征方面。从冷冻组织样本中高效提取MPs仍然具有挑战性，这限制了我们研究其在病理过程中的功能的能力。在这项研究中，我们开发了一种基于金属有机框架（MOFs）的生物分离策略，使用沸石咪唑框架-67（ZIF-67）从冷冻小鼠肺组织中高效分离膜蛋白组。我们优化了MPs提取的关键参数，包括蛋白质提取方法（组织研磨与酶解）、材料与蛋白质的比例以及SDS浓度。结果表明，与商业试剂盒方法相比，使用ZIF-67和酶解的策略显著提高了具有多个跨膜结构域（TMs≥2）的MPs的富集效率。特别是在通过优化的ZIF-67策略分离出的500种最丰富的MPs中，有133种是具有TMs≥2的MPs，是试剂盒方法的2.18倍。我们进一步将这种策略应用于分析两种不同类型的临床肺癌组织样本（磨玻璃样不透明结节和实性结节）。定量蛋白质组学分析揭示了两种肺癌结节中不同的膜蛋白谱型和失调的通路。ZIF-67策略在分析多跨膜蛋白组方面的增强能力为研究不同结节类型的潜在分子机制提供了有价值的生物学信息。该策略与冷冻组织的兼容性凸显了其在转化医学和生物医学研究中的广泛应用前景，为深入探索MPs在疾病机制和治疗开发中的作用铺平了道路。

引言

膜蛋白（MPs）根据其在生物膜中的分布方式分为外周膜蛋白、脂质锚定膜蛋白和整合膜蛋白[1]。由于其结构特性，MPs具有多种生物学功能，如膜结构稳定、信号转导、跨膜运输和催化作用。G蛋白偶联受体（GPCRs）因其7个跨膜结构域而成为最重要的药物靶点之一。膜蛋白的异常表达对细胞生理活动和整体健康有深远影响。特别是，MPs是许多疾病（包括癌症）的重要治疗靶点[2]。例如，肺癌是最常见的癌症之一，非小细胞肺癌（NSCLC）约占病例的85%[3]。NSCLC的关键驱动基因，包括表皮生长因子受体（EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（ALK）和c-ros癌基因1（ROS1），都是编码跨膜蛋白的基因。然而，由于MPs的溶解度低、疏水性高和丰度低，它们的分析存在重大挑战，使得溶解、分离和表征特别困难。

几十年来，研究人员开发了几种从细胞和新鲜组织中提取MPs的方法，主要包括表面活性剂提取[4]、离子液体辅助提取[5]、模拟膜的双亲性物质提取[6]、变性剂交联固定提取[7]和固相提取（SPE）。我们之前的工作使用疏水性基质（包括氧化石墨烯（GO）[8]和金属有机框架（MOFs）[9]开发了高效的SPE方法来分离MPs。MOFs是通过金属离子和有机配体通过配位键自组装形成的。它们具有多种有用特性，如较大的比表面积、可调的结构和优异的化学稳定性。这些特性使MOFs在气体吸附和分离、催化、传感和药物递送等多种应用中非常吸引人[[10], [11], [12]]。在MOFs材料中，沸石咪唑框架（ZIFs）已成为生物医学应用的有希望的候选者。ZIF-67通过Zn²⁺离子与2-甲基咪唑的配位合成，显示出优异的疏水特性和更高的MPs提取稳定性[13,14]。我们将ZIF-67应用于从人类肺癌细胞中富集MPs，从而鉴定出与肺癌转移相关的标志物[9]。

随着低剂量计算机断层扫描在肺癌筛查中的广泛采用，包括磨玻璃样不透明（GGO）结节和实性结节在内的肺部结节的检测率显著增加[15]。这些结节根据成像研究中观察到的固体与肿瘤比例（CTR）进行分类[16]。虽然GGO肺癌以其缓慢的进展和良好的预后而著称[[17], [18], [19]]，但其潜在机制仍不清楚。对于新鲜组织样本，可以很容易地制备单细胞悬浮液用于亚细胞蛋白质组分析和生物医学研究[20]，而在临床中很难获得这样的样本。冷冻组织样本通常用于生物医学研究，但组织细胞膜在样本预处理过程中特别容易碎裂，导致蛋白质交叉污染和MPs的大量损失。尽管原位质谱技术已经证明可以直接从冷冻组织样本中检测到MPs，但该方法检测到的膜蛋白数量非常有限，主要是低分子量的MPs（<50 kDa）[21,22]。目前从冷冻组织中提取MPs主要依赖于商业试剂盒方法。然而，提取效率通常较低，特别是对于具有多个跨膜结构域的MPs。这突显了开发一种高效且经济可行的MPs提取策略的必要性，以便从冷冻组织中提取膜蛋白组。

在这里，我们旨在开发一种简单的MOFs策略，用于从冷冻组织中高效富集MPs，尤其是多跨膜MPs。使用冷冻小鼠肺组织作为实验模型，我们系统地优化了MPs分离的关键参数，包括蛋白质提取方法（研磨和酶解）、材料与蛋白质的比例以及洗脱条件。通过与商业试剂盒方法的比较，评估了优化后的ZIF-67策略的性能，特别是其富集具有多个跨膜结构域的疏水性MPs的能力。使用优化的ZIF-67策略对冷冻NSCLC组织进行定量蛋白质组学分析，揭示了GGO结节和实性结节之间不同的膜蛋白谱型，突显了我们基于ZIF-67的方法作为研究膜蛋白组差异及其在肿瘤生物学中作用的强大工具。

章节片段

研磨方法

使用眼科剪刀将C57BL/6野生型小鼠的20-40毫克冷冻肺组织切成约2×2×2毫米3的小块，置于PBS中。向沉淀物中加入适量的含有1:50（v/v）比例蛋白酶抑制剂的PBS。然后将混合物转移到Dounce 451中，并进行50次搅拌以实现均质化。研磨后的组织溶液进一步用于通过ZIF-67方法提取膜蛋白。

酶解方法

20-40毫克C57BL/6野生型小鼠的冷冻肺组织被切

使用机械研磨优化ZIF-67方法提取组织膜蛋白

我们之前建立的ZIF-67方法用于培养细胞的MPs提取[9]。本研究的目的是开发一种适用于冷冻组织样本的高效MPs提取方法。图1展示了MOFs和试剂盒辅助MPs提取策略的概述。

使用C57BL/6野生型小鼠的冷冻肺组织，我们优化了实验参数以提高ZIF-67方法的MPs提取性能。为了减少非膜蛋白的干扰，

结论

总之，我们开发了一种基于MOFs纳米材料的生物分离策略，用于从冷冻组织样本中提取膜蛋白，该方法成本低廉且效率高。通过系统优化关键参数，我们证明了使用酶解的ZIF-67策略在富集具有多个跨膜结构域的MPs方面显著优于商业试剂盒方法。当应用于临床组织样本时，ZIF-67策略提供了全面的跨膜蛋白组谱型

数据可用性

质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴仓库存入ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD061810（用户名：reviewer_pxd061810 @ebi.ac.uk，密码：iav2xPbSZkEO）。

作者贡献

H.X.和Y.Z.参与了研究设计。L. Zhu和L.Q.Q.参与了样本收集。L. Zhu和M.G.进行了实验并收集了数据。L.Q.Q.收集了临床数据。L. Zhu、M.G.、Y.J.L.、L.Z.、S.T.L.、J.Q.Z.、J.Z.Z.、M.H.S.、Y.Z.和H.X.参与了数据分析。H.X.和Y.Z.参与了资金筹集。手稿由L. Zhu和H.X.撰写。所有作者都审阅了手稿。研究的各个方面都由H.X.监督

缩写列表

具有GGO结节的患者的正常组织具有GGO结节的患者的癌旁组织癌性

缩写	全名
ZIF-67	沸石咪唑框架67
MOFs	金属有机框架
GGO	磨玻璃样不透明
Mr	分子量
GRAVY	平均疏水性
TMs	跨膜结构域
LC-MS/MS	液相色谱-串联质谱
GPCRs	G蛋白偶联受体
MPs	膜蛋白
NSCLC	非小细胞肺癌
SDS	十二烷基硫酸钠
FASP	辅助过滤样品制备
GN
GP
GC

CRediT作者贡献声明

李珠：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理。苗国：撰写——原始草稿，数据管理。应佳刘：数据管理。卢张：数据管理。孙涛李：数据管理。贾琪赵：数据管理。建正朱：数据管理。梅慧桑：数据管理。励强钱：概念构思。严张：概念构思。华晓：撰写——审阅与编辑，监督，方法学，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号22374098）、上海市自然科学基金（编号23ZR1434200、21ZR1433200、19ZR1427800）、浙江省多组学和分子酶学重点实验室基金（编号2025ZD001）以及上海交通大学重点科研项目（编号WH630108001/038、TMSK-2020-130）的支持。