《Advanced Science》：PARPi Combining Nanoparticle LIN28B siRNA for the Management of Malignant Ascites
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本文推荐一篇关于恶性浆液性积液（MSE）治疗策略的创新性研究。该研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和基因组学分析，发现LIN28B高表达和DNA修复通路异常是MSE的关键特征。作者开发了一种叶酸靶向的siRNA纳米递送系统（siLin28b/DSSP@lip-PEG-FA），并与PARP抑制剂（PARPi）BMN673联用，在临床前卵巢癌（OC）模型中显著抑制了恶性腹水（MA）积聚并延长了生存期。其作用机制涉及重塑肿瘤免疫微环境（如减少M2巨噬细胞和Arg1阳性中性粒细胞）以及增强血管紧密连接完整性。该双靶向策略为晚期癌症患者的MA管理提供了有前景的新方案。
1 引言
恶性浆液性积液（MSE），包括恶性胸腔积液（MPE）和恶性腹水（MA），是晚期恶性肿瘤常见且严重的并发症，与预后不良和高复发率相关。目前，MSE的治疗缺乏标准化方案，存在显著的临床挑战。本研究通过对患者和临床前样本的分析，发现LIN28B表达上调和DNA修复通路失调是MSE的两个主要分子特征。为此，研究团队开发了一种靶向siRNA纳米颗粒递送系统（siLin28B/DSSP@lip-PEG-FA），并与PARP抑制剂BMN673联用，形成了一种协同治疗MSE的策略。
2 结果
2.1 LIN28B异常表达与DNA修复通路与MSE相关
在构建的卵巢癌临床前模型中，肿瘤小鼠出现了大量恶性腹水，并伴有肠系膜血管系统受损。单细胞RNA测序分析显示，在临床前模型和卵巢癌患者样本中，癌细胞差异表达基因的交集中有6个共同基因，其中LIN28B在癌细胞中持续显著上调。此外，对442个MSE样本的测序分析发现，单核苷酸变异（SNV）和拷贝数变异（CNV）相关的基因显著富集于DNA修复通路，如PI3K-Akt、MAPK、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药和p53信号通路。这些结果表明，LIN28B表达升高和DNA修复通路异常是MSE的关键分子特征。
2.2 靶向LIN28B的DSSP@lip-PEG-FA的合成与表征
2.2.1 DSSP的表征
研究合成了具有氧化还原响应性的聚胺DSSP，并通过IR、1H NMR和13C NMR确认了其化学结构。DSSP具有较低的细胞毒性，并保留了良好的质子缓冲能力。
2.2.2 siRNA/DSSP@lip-PEG-FA的表征
当DSSP与siRNA的质量比超过4:1时，能实现siRNA的完全缩合。将siRNA/DSSP纳米颗粒与预形成的脂质体结合，制备出siRNA/DSSP@lip-PEG-FA。该纳米颗粒在氧化条件下能快速释放siRNA，在生理条件下则泄漏率低，表现出良好的稳定性和氧化还原响应性。细胞实验表明，siRNA/DSSP@lip-PEG-FA能通过叶酸受体介导的内吞作用被细胞高效摄取，并能有效逃逸溶酶体，将siRNA递送至细胞质。Western blot证实，siLin28b/DSSP@lip-PEG-FA能有效敲低A2780、ID8和HCT116细胞中Lin28b的蛋白表达。体内实验进一步显示了其良好的肿瘤靶向性。
2.3 siLin28b与DNA损伤抑制协同限制MA进展
2.3.1 siLin28b与BMN673协同抑制肿瘤生长
鉴于具有DNA修复缺陷的癌细胞对PARP抑制剂特别敏感，研究评估了siLin28b与BMN673联用的效果。体外克隆形成实验表明，两者联用能显著抑制A2780和HCT116细胞的集落形成。在皮下移植瘤模型中，联合疗法能适度抑制HCT116肿瘤生长，且未引起显著体重下降。在ID8-Luciferase卵巢癌模型中，联合治疗能适度降低肿瘤负荷，并显著减少Ki67阳性增殖细胞，增加TUNEL阳性凋亡细胞。
2.3.2 siLin28b与BMN673协同抑制MA积聚
在抑制腹水方面，联合疗法效果最为显著。至第45天，联合治疗组小鼠的腹围远小于Vehicle组，超声成像也显示腹腔液高度显著降低。联合治疗还显著延迟了MA的出现时间，并延长了小鼠的无腹水生存期和总生存期。
2.3.3 siLin28b联合BMN673在非卵巢MA模型中抑制MA积聚
在CT26结肠癌来源的腹水模型中，联合治疗同样能显著抑制腹水进展，表明该策略在不同癌种MA模型中的普适性。
2.4 siLin28b联合BMN673通过调节M2巨噬细胞和中性粒细胞亚型重塑腹水微环境
单细胞RNA测序分析了ID8小鼠模型腹水中的19022个细胞。联合治疗后，M2样巨噬细胞的比例显著降低。基因本体生物过程（GO-BP）分析显示，联合治疗增强了巨噬细胞中免疫相关通路的激活。细胞间相互作用分析表明，联合治疗显著减少了M2样巨噬细胞与癌细胞之间的通讯。对1636个中性粒细胞的深入分析揭示了10个不同的亚群，其中Neu-07-Cd34和Neu-08-Arg1亚群在联合治疗后显著减少。伪时间轨迹分析提示这些亚群可能起源于Neu-09-C1qc集群。值得注意的是，与不良预后相关的中性粒细胞亚群高表达免疫耗竭标志物Pdcd1和Cd274。细胞因子分析显示，联合治疗降低了巨噬细胞和癌细胞中IL-6和IL-10的水平，同时增加了T细胞中的表达。通过特异性细胞清除实验证实，中性粒细胞在调节腹水形成中起关键作用，而CD8+T细胞和巨噬细胞的清除则无此效果。
2.5 siLin28b联合BMN673抑制血管通透性恶化
RNA-seq分析发现，联合治疗上调了与内皮细胞迁移和连接组织相关的通路。Luminex检测显示，联合治疗显著降低了腹水微环境中TNF-α、IL-6和IL-10等促炎细胞因子的分泌。Evans blue渗透性实验和免疫染色证实，联合治疗能显著改善血管完整性，减少红细胞外渗。体外实验表明，联合治疗能恢复被TNF-α或LPS破坏的内皮细胞单层连接。生物安全性评价显示，联合治疗未引起主要器官的显著病理改变或系统性毒性，具有良好的安全性。
3 讨论
本研究揭示了LIN28B和PARP在MA中的新作用，并提出了一种联合靶向治疗策略。LIN28B在恶性组织中特异性再激活，使其成为理想的治疗靶点。PARP抑制剂除了经典的DNA修复抑制功能外，本研究还发现其能调节血管完整性。联合治疗通过多细胞、多通路协同作用，有效抑制MA积聚，包括直接抑制癌细胞、重塑免疫微环境（减少免疫抑制性M2巨噬细胞和中性粒细胞亚群）以及增强血管内皮屏障功能。与VEGF抑制剂相比，该策略可能具有更好的安全性。研究的局限性包括具体分子机制需进一步阐明，免疫细胞中LIN28B的作用有待探索，以及纳米颗粒的临床转化需要符合GMP标准的人源化制备。
4 实验与方法
研究涵盖了材料（包括患者样本、质粒与抗体、化学化合物）、批量与单细胞转录组分析、SNV与CNV分析、DSSP的合成、质子缓冲能力测定、纳米颗粒表征、细胞实验（细胞培养、 cytotoxicity、细胞内吞、转染效率、免疫染色、通透性测定）和动物实验（动物模型、体内分布、抗肿瘤分析、抗恶性腹水评价、免疫细胞调节、生物相容性评价等）。统计分析使用GraphPad 9.0软件进行。所有测序数据已存入GEO数据库。
