间充质干细胞来源的细胞外囊泡通过内源性阿片系统缓解糖尿病神经病变疼痛的机制研究

《Advanced Therapeutics》：Extracellular Vesicles Derived From Mesenchymal Bone Marrow Cells Promote Antinociception in a Murine Model of Diabetic Neuropathy via the Endogenous Opioid System

本文揭示了人骨髓间充质干细胞（BMSC）及其来源的细胞外囊泡（EV-BMSC）在糖尿病感觉神经病变（DSN）小鼠模型中均能产生显著的镇痛效果。研究表明，单次静脉注射EV-BMSC即可逆转机械性异常性疼痛，其作用与亲本BMSC移植相当，且该镇痛效应可被阿片受体拮抗剂纳洛酮（Naloxone）逆转。分子机制探索发现，EV-BMSC治疗能持久上调脊髓背角前脑啡肽原（preproenkephalin）的表达。这项工作首次证实EV-BMSC通过激活内源性阿片系统发挥镇痛作用，为开发基于细胞外囊泡的无细胞疗法治疗难治性糖尿病神经病变提供了新的理论依据和实验证据。

　　

引言

糖尿病影响着全球约5.37亿成年人，并可引起多种并发症，其中糖尿病感觉神经病变（Diabetic Sensory Neuropathy, DSN）是最常见的类型之一，其特征是感觉异常，包括阵发性疼痛、异常性疼痛和痛觉过敏，常伴有感觉丧失。目前针对DSN疼痛的药物治疗效果不佳且副作用多，严重影响患者的生活质量和治疗依从性，因此开发新的治疗策略迫在眉睫。

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSC）因其神经保护和抗神经退行性变的特性，在神经系统疾病治疗中展现出潜力。研究表明，骨髓间充质干细胞/基质细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells, BMSC）能够逆转神经病理性疼痛并调节其维持的病理生理过程。其治疗效应可能主要由旁分泌作用介导。MSC分泌多种生物活性分子，统称为分泌组，其中包含直接释放或包裹在细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）中的功能性RNA、DNA、脂质和蛋白质。EVs在长距离细胞间通讯中扮演关键角色。MSC来源的EVs在神经系统疾病治疗中显示出潜力，但其在DSN中的作用尚未明确。MSC的镇痛机制尚未完全阐明，但证据表明内源性阿片系统可能参与其中。

材料与方法

细胞与囊泡获取与鉴定

BMSC来源于参与慢性脊髓损伤自体干细胞移植I/II期临床试验的18-65岁捐赠者。细胞在无血清培养基中培养扩增。EVs通过从1×10⁶个BMSC的培养上清液中经差速离心和超速离心分离获得。BMSC通过流式细胞术鉴定其高表达CD90、CD44、CD105和CD73等间充质标志物，并具有成脂、成软骨和成骨分化能力。EV-BMSC通过纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）和斑点杂交（Dot Blot）进行表征。NTA显示从1×10⁶个BMSC中回收的EVs总数约为4.4×10⁸个颗粒，直径范围在52.4至450纳米之间，平均尺寸为177.3纳米，模式尺寸为154.3纳米，表明样品中包含外泌体和微囊泡的混合群体。TEM观察显示EVs具有典型的圆形形态和双膜结构。斑点杂交证实EVs表达标志性蛋白CD9、CD81和TSG101。

动物模型与实验设计

实验使用3-4月龄雄性C57BL/6小鼠。通过连续三天腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ, 80 mg kg^?1）诱导糖尿病神经病变模型，血糖水平持续高于250 mg dL^?1的小鼠被视为糖尿病模型。整个实验周期为92天，包括30天的模型诱导期和62天的治疗后观察期。在糖尿病诱导30天后（记为第0天），小鼠被随机分为几组，并接受单次静脉注射： Vehicle（对照组）、EV-BMSC（100 μL，相当于约2.5×10⁷个颗粒或1.76×10⁶颗粒/克体重）、或BMSC（1×10⁶个细胞）。为探究阿片系统的作用，在治疗后第7、30和60天，部分小鼠还接受了纳洛酮（Naloxone, NLX, 5 mg kg^?1）腹腔注射。

行为学与分子生物学分析

机械性伤害感受阈值使用Von Frey纤维丝通过上下法测定。在治疗后的第7天和第60天，收集小鼠腰膨大（L4-L5）脊髓节段，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测前脑啡肽原（preproenkephalin）的mRNA表达水平，以内参GAPDH进行标准化。同时，也检测了体外培养的BMSC中前脑啡肽原的表达。

结果

BMSC与EV-BMSC的表征

BMSC成功表达了间充质细胞表面标志物，并具有多向分化潜能。EV-BMSC表征结果显示其形态、大小和蛋白标志物均符合EVs的特征，证实成功获得了EV-BMSC。

治疗对体重和血糖的影响

与未糖尿病的Naive组小鼠相比，糖尿病小鼠在造模后30天和60天均表现出体重显著下降和血糖水平显著升高。然而，Vehicle、BMSC和EV-BMSC治疗组之间的体重和血糖水平均无显著差异，表明BMSC和EV-BMSC的治疗效果并非通过改善糖尿病本身的代谢异常实现。

治疗对异常性疼痛的影响

在糖尿病诱导后30天（T0），糖尿病小鼠的机械性伤害感受阈值显著低于Naive组，表明出现了机械性异常性疼痛，这种异常性疼痛持续至诱导后第49天。此后，Vehicle治疗的糖尿病小鼠痛阈逐渐升高，出现感觉丧失的迹象。单次静脉注射EV-BMSC或BMSC后，小鼠的痛阈逐渐升高，在治疗后第7天开始出现统计学意义的改善，效果持续至实验结束，表明两种治疗均能逆转DSN小鼠的机械性异常性疼痛。

阿片通路在镇痛中的作用

在治疗后第7、30和60天给予纳洛酮，能瞬时性（30分钟内）逆转BMSC和EV-BMSC诱导的镇痛效应，痛阈在24小时后恢复。纳洛酮本身对非神经病变的Naive小鼠的基础痛阈没有影响，说明其在糖尿病小鼠中的作用是特异性逆转了治疗诱导的镇痛，而非直接改变痛觉敏感性。这强烈提示BMSC和EV-BMSC的镇痛效应依赖于内源性阿片系统的激活。

治疗对脊髓前脑啡肽原表达的影响

在治疗后第7天，与Vehicle组相比，BMSC和EV-BMSC治疗均能显著上调糖尿病小鼠脊髓中前脑啡肽原的mRNA表达水平。在治疗后第60天，Vehicle组糖尿病小鼠的前脑啡肽原表达低于Naive组，而EV-BMSC治疗组仍能维持较高的表达水平，BMSC组则无此持续效应。此外，体外培养的BMSC（第7和第8代）在基础状态下也表达前脑啡肽原，提示移植的细胞本身可能是阿片肽的一个来源。

讨论

本研究首次证实，人源BMSC衍生的EVs（EV-BMSC）在DSN模型中能产生与BMSC移植相似的镇痛效果。行为学药理学实验和基因表达分析共同表明，内源性阿片系统在EV-BMSC和BMSC的镇痛机制中均扮演重要角色。

EV-BMSC治疗糖尿病神经病变展现出巨大潜力。其镇痛效应并非通过控制血糖实现，而是特异性调节神经病变相关的感觉异常。单次给药即可产生持久效果，且EV-BMSC在诱导脊髓前脑啡肽原表达方面表现出比BMSC更持久的效应，这提示无细胞疗法可能具有独特优势。

阿片受体拮抗剂纳洛酮能够逆转镇痛效应，以及脊髓阿片肽前体表达的上调，共同证明了内源性阿片通路的参与。EV-BMSC可能通过其携带的生物活性物质，调节宿主神经系统，促进内源性阿片肽的合成和释放，从而激活下行抑制通路，缓解疼痛。

与BMSC细胞移植相比，EV-BMSC作为一种无细胞疗法，具有潜在的安全性高、免疫原性低、易于储存和标准化生产等优势，为未来临床转化提供了新方向。本研究为开发基于细胞外囊泡的治疗策略干预糖尿病神经病变疼痛奠定了重要的实验基础。

结论

本研究表明，EV-BMSC能通过内源性阿片系统产生显著的镇痛作用，效果与BMSC移植相当。这些发现证实了无细胞疗法，特别是EV-BMSC，作为治疗难治性感觉神经病变的一种有前景策略的潜力。未来需要对囊泡制备和剂量进行进一步标准化研究。