《Advanced Science》：Identification of a Force-Induced Sox9+Acan+ Transitional Subpopulation Linked to FGF2–FGFR2–ERK Signaling in Orthodontic Bone Remodeling
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本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）鉴定出一种新型的力学敏感性Sox9+Acan+间充质过渡细胞亚群，该细胞在过度正畸力作用下通过激活FGF2–FGFR2–ERK信号轴促进破骨细胞生成，导致正畸相关性炎性牙根吸收（OIIRR）。研究进一步开发了GelMA@siRNA水凝胶缓释系统，通过局部靶向沉默Sox9表达，有效减轻了牙根吸收，为控制正畸牙移动（OTM）中的病理性骨重塑提供了新的治疗策略。
1 引言
正畸牙移动（OTM）是一个依赖于牙周微环境中骨重塑的力学驱动过程，其中压力侧发生骨吸收，张力侧发生骨形成。然而，过度或不当的矫治力会加剧炎症反应和组织损伤，导致正畸相关性炎性牙根吸收（OIIRR）。OIIRR的风险和严重程度在使用固定矫治器、大力值、牙齿压低、转矩、长疗程、关闭拔牙间隙或上颌切牙大范围移动时会增加。目前认为，牙周膜细胞（PDLCs）、成骨细胞、成牙骨质细胞和免疫细胞等多种细胞类型参与了这一过程，但牙周微环境中界定生理性重塑和病理性牙根吸收的细胞异质性仍不清楚。
2 结果
2.1 单细胞RNA测序揭示力学敏感性Sox9+Acan+细胞
通过建立过度力（50克）OTM小鼠模型，并利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析加载1天后的牙周组织，研究人员鉴定出14个细胞谱系。对间充质谱系细胞进行亚群分析后，发现了五个亚群：间充质干细胞（MSCs）、成牙骨质细胞、成骨细胞、成纤维细胞以及一个先前未被识别的共表达Sox9和Acan的细胞簇。在加载力组（T组）中，Sox9+Acan+细胞占间充质谱系细胞的10.86%，而在对照组（C组）中仅为5.94%，增加近一倍。RNA速度分析显示从MSCs向Sox9+Acan+状态存在明确的定向流动，表明该过渡程序被主动诱导。伪时间分析将MSCs定位于轨迹起点，Sox9+Acan+细胞处于中间过渡状态。对公共数据集GSE287729的再分析以及对人源SHED细胞数据集（GSE221216）的分析均证实了Sox9+Acan+细胞状态的存在。基因集富集分析（GSEA）显示该细胞群与力作用下的骨吸收和骨重塑通路相关。
2.2 力学力增加Sox9+Acan+细胞并促进破骨细胞生成和免疫调节
RNAscope和EdU双标实验证实，Sox9+Acan+细胞主要定位于牙周膜的压力侧，其数量随加载时间增加而增加，但EdU+细胞未相应增加，表明其群体扩张并非源于增殖。空间分析显示CD86+（M1）巨噬细胞在Sox9+细胞附近浸润增加。多重免疫组化（mIHC）显示，加载7天后，在吸收陷窝内检测到SOX9+ACAN+双阳性细胞与组织蛋白酶K（CTSK）阳性的破骨细胞相邻。体外实验表明，静态压力（2克/平方厘米）可诱导小鼠PDLCs中SOX9和ACAN的共定位及表达上调。来自受力PDLCs的条件培养基（CM）可显著增强骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的破骨细胞形成。
2.3 Sox9 manipulation alters mouse PDLCs osteogenesis and paracrine signaling
在小鼠PDLCs中进行Sox9的敲低（KD）和过表达（OE）实验。Sox9 KD降低了Sox9+Acan+双阳性细胞的比例，并增强了细胞的成骨分化能力（表现为ALP和ARS染色矿化增加，RUNX2蛋白及成骨基因Runx2、Osx、Bsp、Opn表达上调）。相反，Sox9 OE则抑制成骨分化。将经过操作的PDLCs的条件培养基用于诱导BMDMs向破骨细胞分化，发现来自Sox9 OE细胞的CM能促进破骨细胞相关基因（Ctsk, Trap, Mmp9）表达，并增加破骨细胞的大小、数量和多核化；而来自Sox9 KD细胞的CM则强烈抑制破骨细胞形成。
2.4 力学加载下间充质与巨噬细胞群体间的FGF2–FGFR2信号
对巨噬细胞亚群的再聚类识别出四个亚群：Macro1（表达Apoe, Fpr2）、Macro2（表达Kif4, Cdca2）、Macro3（表达Plpp5, Ccnb2）和Macro4（表达Mmp14, C3ar1）。Macro4在加载组中的比例从对照组的3.01%增加到6.37%，富集分析表明其与骨吸收和重塑过程相关，被认为是破骨细胞前体巨噬细胞。CellChat分析揭示，在加载组中，PDLCs与Macro4之间出现了新的FGF信号交互，其中FGF2–FGFR2配体-受体对的贡献最大。实验验证显示，力学应激和Sox9操作均能调节PDLCs中FGF2的表达和分泌。
2.5 FGF2–FGFR2信号轴的实验验证
免疫荧光显示，加载7天后，压力侧FGF2表达升高，F4/80（巨噬细胞标记）与FGFR2的共定位增加。用来自受力PDLCs的条件培养基处理BMDMs，并加入外源性FGF2和/或FGFR抑制剂Erdafitinib，Western blot证实FGF2主要通过激活ERK1/2通路（而非p38、JNK、AKT或FAK通路）促进破骨细胞分化，且此效应可被Erdafitinib阻断。FGFR2表达受FGF2适度上调，而FGFR1无变化。
2.6 局部抑制牙周间充质细胞中Sox9表达可减轻牙根吸收
为解决直接注射siRNA效果短暂的问题，研究开发了可注射的GelMA@siRNA水凝胶缓释系统。该系统具有良好的生物相容性和可持续的siRNA释放特性。体内实验表明，与单纯siRNA注射或空白GelMA相比，GelMA@siRNA处理能持久抑制Sox9+Acan+细胞，显著降低压力侧CTSK表达、增加骨桥蛋白（OPN）表达，并有效减轻Micro-CT观察到的牙根吸收程度，同时适度延迟牙齿移动。
3 讨论
本研究利用过度力OTM模型和scRNA-seq技术，揭示了Sox9+Acan+过渡间充质细胞亚群在早期力学响应中的关键作用。该细胞通过分泌FGF2，激活巨噬细胞上的FGFR2–ERK信号通路，促进破骨细胞生成。所开发的GelMA@siRNA局部递送系统能够特异性靶向并抑制该细胞亚群的功能，为减轻OIIRR提供了一种有前景的治疗策略。这一发现不仅深化了对牙周骨重塑机制的理解，也为骨骼力学生物学中基质细胞整合力学信号与骨免疫调控提供了新的范式。
4 结论
研究阐明了一个力诱导的Sox9+Acan+过渡间充质细胞群体在正畸牙移动中通过激活FGF2–FGFR2–ERK信号通路促进破骨细胞生成。概念上，这项工作确定了一个力学响应性基质中间体，它将力学线索与骨免疫调控整合起来，扩展了当前牙周和骨骼力学生物学的范式。临床上，GelMA@siRNA平台实现了局部、瞬时的Sox9抑制，为抑制病理性破骨细胞过度活化、减轻牙根吸收而不影响牙齿移动提供了一种实用策略。
