从膜荚黄芪（Astragalus membranaceus）中依次采用超临界萃取和加压液体萃取方法提取黄酮类化合物：优化提取效率并保持糖苷的完整性

《The Journal of Supercritical Fluids》：Sequential supercritical and pressurized liquid extraction of flavonoids from Astragalus membranaceus: optimizing yield and preserving glycoside integrity

黄芪根部黄酮类化合物提取效率及成分分析：研究对比了超临界CO2萃取(SFE)与加压液相萃取(PLE)两种高压提取方法，发现PLE采用乙醇时黄酮产率达9.1mg/100g，显著高于SFE。两种方法提取的黄酮糖苷与苷元比例存在差异，推测SFE的CO2预处理有效去除了水溶性杂质，抑制了糖苷水解。

　　

玛丽·萨伊弗托娃（Marie Sajfrtová）|海伦娜·索沃娃（Helena Sovová）|娜杰日达·弗尔霍托娃（Nadě?da Vrchotová）|扬·特里斯卡（Jan T?íska）|罗曼·帕夫莱拉（Roman Pavela）

化学过程基础研究所（Institute of Chemical Process Fundamentals），捷克科学院（CAS），捷克共和国布拉格165 02

摘要

黄芪（Astragalus membranaceus，AR）的根是应用最广泛的中国草药之一，用于治疗多种疾病。其生物活性成分包括黄酮类化合物（FL），包括苷类和苷元。本研究的目的是探讨连续提取方法对黄酮类化合物产量及其组成的影响。研究采用了两种高压提取技术：超临界流体萃取（SFE）和加压液体萃取（PLE）。作为CO₂改性剂和溶剂分别使用了乙醇、甲醇、乙酸乙酯和水。提取过程的顺序为：纯超临界CO₂、改性CO₂、加压有机溶剂以及过热水。

实验结果表明：随着改性剂极性的增加（从乙酸乙酯到乙醇、甲醇），黄酮类化合物的产量逐渐提高，而使用水作为改性剂时产量则下降。在120°C和10 MPa的压力条件下，使用乙醇进行加压液体萃取（PLE）时获得了最高的黄酮类化合物产量（9.1 mg/100 g AR）。在超临界流体萃取（SFE）中，CO₂改性剂的极性与黄酮类化合物产量的关系也类似，但产量较低。因此，从黄酮类化合物的产量来看，简单加压液体萃取（PLE）与复杂的连续提取方法（SFE+PLE）之间几乎没有差异。然而，在苷类与苷元的比例上存在显著差异，连续提取方法得到的比例更高。研究推测，SFE过程能够去除黄芪中的水分，从而防止后续加压液体萃取过程中苷类的水解。

引言

黄芪（Astragalus membranaceus，AR）的根是一种历史悠久、临床应用广泛的传统中药[1]。其主要活性成分包括多糖、黄酮类化合物和皂苷。其中最丰富的皂苷是黄芪苷IV（astragaloside IV，简称AG-IV），它是黄芪质量控制的化学标志物。已从黄芪中分离出60多种黄酮类化合物，其中环苷素-7-O-β-D-葡萄糖苷（calycosin-7-O-β-D-glucoside）被用作中国药典中黄芪质量控制的另一种化学指标[2]。黄芪中的其他重要黄酮类成分还包括佛波内汀（formononetin）、奥诺宁（ononin）和环苷素（calycosin）[3]。本文综述了黄芪的生物活性成分及其对神经系统退行性疾病、糖尿病和癌症的潜在健康益处，以及其食用方式、剂量和纳入饮食的理由[4]。黄酮类化合物的药理作用包括抗炎、抗肿瘤、降血糖、免疫调节和抗病毒作用[5]。针对黄芪中的五种主要活性成分（包括环苷素-7-O-β-D-葡萄糖苷和环苷素），研究了它们对心血管和脑血管疾病的影响[6]。近期研究重点关注了黄芪成分的抗肿瘤活性[5][7][8]。

黄芪多糖的大分子提取方法与皂苷和黄酮类小分子的提取方法有所不同[1]。对于多糖，常用的提取方法包括水提取、微波辅助提取、超声提取和酶提取。研究表明，使用超声辅助提取从发酵黄芪中提取的多糖产量高于传统热水提取[9]。深度共晶溶剂的研究为植物多糖的提取提供了新的思路[10][11]。

黄芪中皂苷和黄酮类化合物的主要提取方法包括回流提取、微波辅助提取等[1]。在大多数关于黄芪异黄酮成分的研究中，更多关注的是色谱分离和检测，而非提取前的样品处理。通常采用HPLC-UV-蒸发光散射检测方法对提取后的样品进行鉴定[12]。另一项研究显示，微波辅助提取的效率高于索氏提取（Soxhlet extraction）、回流提取和超声提取[12]。还有研究采用甲醇对黄芪粉末进行3小时回流提取，并结合HPLC-光电二极管阵列检测和电喷雾离子化质谱技术分析了其中的黄酮类化合物[13]。另有研究比较了两种提取方法：一种是将黄芪样品在水中煮沸60分钟，另一种是使用70%甲醇在40°C下进行超声处理60分钟[14]。2021年首次报道了加压液体萃取技术，将其与在线二维逆流色谱结合使用，用于高效提取和分离黄芪中的六种黄酮类化合物[15]。还有研究使用半制备型高效液相色谱结合梯度洗脱（水-甲醇混合物）分离了四种黄酮类化合物和两种黄芪苷[16]。在制备规模上，黄芪中黄酮类化合物的提取方法目前仍以回流提取为主。从黄芪中分离环苷素-7-O-β-D-葡萄糖苷的第一步是使用甲醇进行两次回流提取，每次提取时间为6小时[17]。同样，也使用乙醇进行回流提取以获得黄芪中的环苷和佛波内汀[18]。加入盐酸可诱导目标化合物中苷类的水解[18]。显然，其他提取方法的潜力仍有待进一步探索。

本研究的目的是依次应用两种高压提取技术，并探讨它们对黄酮类化合物产量及其组成的影响。

实验部分

实验方案

在化学过程基础研究所的实验室中，开发了从植物和草药中提取生物活性物质的高压提取方案。高压提取过程中使用的溶剂顺序为：纯CO₂ – 改性CO₂ – 与改性剂相同的溶剂 – 过热水。随着提取过程的进行，被提取物质的极性逐渐增加（最初提取出的主要是角质蜡和油脂）

结果

连续提取方法的提取效率与索氏提取方法相当。索氏提取的总产量为112.2 mg/g AR，而黄酮类化合物的总产量（按提取物中黄酮类化合物的总量计算）为58.02 μg/g AR（见表2）。根据索氏提取的结果，根部中鉴定的苷类化合物含量（24.06 μg/g AR，化合物1-5）低于苷元含量（33.96 μg/g AR，化合物6、8）

讨论

文献表明，黄芪中黄酮类化合物的含量存在显著差异，这受栽培区域、生长周期和生长条件的影响。例如，Park等人[17]从黄芪中分离出环苷素-7-O-β-D-葡萄糖苷，产率为63.04 μg/g AR；而Kim等人[21]分析的黄芪中该化合物的含量仅为4.88 μg/g，环苷素的含量为1.64 μg/g。在本研究中，黄芪中环苷及其苷类的总含量为24.6 μg/g AR。Lv等人[...]的研究发现黄芪中的黄酮类化合物含量更高

结论

本研究考察了使用不同改性剂（CO₂在SFE中或加压液体在PLE中）进行高压连续提取时，黄酮类化合物（黄芪中的生物活性成分）的提取效率。最有效的CO₂改性剂是甲醇，而最有效的加压液体是甲醇和乙醇，鉴于其无毒性质，这些方法更适合用于医药和食品领域。黄芪中的主要黄酮类化合物包括环苷素等

CRediT作者贡献声明

罗曼·帕夫莱拉（Roman Pavela）：负责项目监督和管理。扬·特里斯卡（Jan T?íska）：负责撰写、审稿与编辑工作，以及方法学设计和概念构建。娜杰日达·弗尔霍托娃（Nadě?da Vrchotová）：负责数据验证、实验调查和数据管理。海伦娜·索沃娃（Helena Sovová）：负责初稿撰写、数据管理和概念构建。玛丽·萨伊弗托娃（Marie Sajfrtová）：负责初稿撰写和方法学设计。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢凯特琳娜·瓦韦罗娃（Kate?ina Vaverová）协助进行提取实验。本研究得到了捷克农业部（“食品工业中的药用植物——预防文明病的新型方法”，项目编号QL24010019）和捷克教育、青年与体育部（项目CzeCOS，编号LM2023048）的支持。