《Journal of Virological Methods》：Comparative analysis of beet western yellows virus detection methods: Development and validation of a novel real-time RT-PCR assay also targeting beet leaf yellowing virus
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病毒 yellows 病毒检测方法；实时荧光逆转录聚合酶链式反应；糖用甜菜 western yellows 病毒；甜菜黄化病毒；农业病毒学诊断；多组学检测体系|植物病毒检测；交叉反应消除；RT-qPCR 验证标准；农业虫害管理
赫林·皮埃尔（Hellin Pierre）、埃维拉特·艾伦（Everaert Ellen）、德蒙蒂·伊丽莎白（Demonty Elisabeth）、里谢特·波琳（Richet Pauline）、穆霍夫斯基·约丹（Muhovski Yordan）、德容赫·克里斯（De Jonghe Kris）、奥蒂埃·路易斯（Hautier Louis）、施泰尔·斯特凡（Steyer Stéphan）
比利时杰姆布卢（Gembloux）的瓦隆农业研究中心——植物与森林健康部门
摘要 甜菜西部黄化病毒（BWYV – Polerovirus BWYV）是一种与甜菜及其他多种作物黄化及生长受阻症状相关的细小病毒。由于该病毒与其他感染甜菜的细小病毒之间存在密切关系，加之血清学交叉反应性和有限的分子数据，长期以来其准确诊断一直较为复杂。为解决这些问题，我们开发了一种新型实时RT-PCR检测方法，能够特异性且灵敏地检测BWYV和甜菜叶黄化病毒（BLYV – Polerovirus BLYV）。该方法基于经过整理的基因组数据集设计，确保了检测的全面性，并与经过验证的参考方法（包括半通用ELISA和通用细小病毒RT-PCR）进行了并行测试。根据EPPO PM 7/98(5)标准进行的全面验证证实了该方法具有高分析灵敏度、特异性、重复性和可重复性。该检测方法对操作过程中的变化具有较好的鲁棒性，并且适用于多重诊断流程。与现有方法相比，它具有更快的检测速度和更高的可靠性，同时消除了与非目标细小病毒的交叉反应。这一方法为准确监测BWYV提供了有力工具，有助于改进农业和植物保护领域中对甜菜病毒黄化病的管理。
引言 甜菜西部黄化病毒（BWYV；Polerovirus BWYV）是一种能够引起甜菜及多种作物（包括菠菜和辣椒等经济重要作物）黄化和生长受阻症状的细小病毒（Beuve等人，2008年；Yoshida和Tamada，2019年）。该病毒已在包括美国、法国、希腊、厄瓜多尔、韩国、日本和中国在内的多个国家被报道（Beuve等人，2008年；Lotos等人，2014年；Miguel等人，2016年；Yan等人，2019年；Yoshida和Tamada，2019年；Kwak等人，2023年；Alvarez-Quinto等人，2024年）。在甜菜中，BWYV属于导致“病毒性黄化”病的病毒复合体之一，这种病害可导致作物产量大幅下降。虽然在美国BWYV较为常见（Wintermantel，2005年），但在欧盟仅有一次正式的感染记录（希腊；Lotos等人，2014年），当地的甜菜黄化病毒复合体通常由甜菜黄化病毒（BYV；Closterovirus favibetae）、甜菜花叶病毒（BtMV；Potyvirus betaceum）以及两种细小病毒——甜菜轻度黄化病毒（BMYV；Polerovirus BMYV）和甜菜褪绿病毒（BChV；Polerovirus BCHV）组成（Hossain等人，2021年；Mahillon等人，2022年）。这些病毒主要由蚜虫（尤其是桃蚜Myzus persicae ）传播。由于目前市场上没有抗该病毒的甜菜品种，最有效的控制措施是喷洒杀虫剂和种子处理。近年来，欧洲禁止使用新烟碱类杀虫剂，使得农民在蚜虫爆发和病毒传播的高发季节面临更少的防治手段。
由于BWYV与芜菁黄化病毒（TuYV；Polerovirus TUYV）和BMYV具有高度遗传和免疫学相似性，过去常被误诊（Stevens等人，2005年；Beuve等人，2008年）。基于多克隆抗体的市售血清学检测方法容易与这些病毒及BChV发生交叉反应（Hossain等人，2021年），从而影响了病毒的准确检测和研究。此外，还有其他密切相关的细小病毒种类，如芸苔黄化病毒（BrYV；Polerovirus TUYV）、甜菜叶黄化病毒（BLYV；Polerovirus BLYV）、葫芦科蚜虫传播的黄化病毒（CABYV；Polerovirus CABYV）以及甜瓜蚜虫传播的黄化病毒（MABYV；Polerovirus MABYV），它们构成了一个有良好系统发育关系的类群，但不同基因组区域的相似性可能有所不同（Yoshida和Tamada，2019年；Latourrette等人，2021年）。
作为替代方案，已经开发出了针对细小病毒和BWYV的PCR检测方法（Robertson等人，1991年；Abraham等人，2007年；Beuve等人，2008年；Knierim等人，2010年；Knierim等人，2013年；Lotos等人，2014年；Eicholtz等人，2018年；Yan等人，2019年；Kwak等人，2023年；Alvarez-Quinto等人，2024年），每种方法各有优缺点。尽管需要扩增后测序才能准确鉴定病毒，但由于一次检测即可检测多种病毒，因此植物诊断实验室通常更倾向于使用通用方法，从而减少了验证大量物种特异性检测的工作负担。EPPO病毒学Q-bank联盟建议使用通用Gen1-2引物进行更广泛的细小病毒检测（
https://qbank.eppo.int/ 在本研究中，我们开发了一种新型RT-qPCR方法，用于同时检测BWYV和BLYV（统称为BWYV样病毒，因两者遗传关系密切且均能感染甜菜）。该方法与其他参考检测方法（ELISA和传统RT-PCR）进行了比较。通过遵循国际标准（EPPO PM7/98 (5)）的严格验证，我们的研究旨在提供一种更特异性和灵敏的BWYV检测工具，并为通用细小病毒检测提供验证数据，以弥补现有方法的局限性。
部分内容摘录 植物材料与阳性对照 病毒分离株主要来自DSMZ的收集（表1）。其他分离株来自CRA-W和ILVO自身的病毒库，或由其他研究机构慷慨提供。为了评估检测方法的性能，部分阳性样本被稀释后用于健康植物基质中培养。健康植物由以下种子培育而成：Beta vulgaris cv. Lysana、Nicotiana tabacum cv. Xanthi、Solanum lycopersicum cv. Marmande、Cucurbita pepo cv. Black Beauty、Capsicum annuum cv.
分析灵敏度 对3株BWYV分离株进行了ELISA、RT-PCR和RT-qPCR方法的灵敏度比较（表2）。总体而言，三种方法的检测结果显示病毒滴度因起始感染材料而异，其中BWYV-USA感染的植物所含病毒量最低。因此，每种方法的检测限（LOD）基于能对所有分离株产生阳性结果的最低稀释度确定。ELISA方法的灵敏度明显低于其他方法。
讨论 本研究结果表明，新开发的RT-qPCR方法能够特异性且灵敏地检测BWYV和BLYV。该检测方法采用一步RT-qPCR流程，使用特异性引物和探针，并结合内部RNA分离对照进行多重检测。该方法基于从GenBank中选取的所有相关BWYV样序列设计。根据EPPO PM 7/98 (5)标准评估的性能指标显示，所开发的RT-qPCR方法具有明显优势。
CRediT作者贡献声明 里谢特·波琳（Richet Pauline）： 验证、数据分析。穆霍夫斯基·约丹（Muhovski Yordan）： 撰写、审稿与编辑、数据分析。德容赫·克里斯（De Jonghe Kris）： 撰写、审稿与编辑、项目监督。奥蒂埃·路易斯（Hautier Louis）： 撰写、审稿与编辑、项目管理。施泰尔·斯特凡（Steyer Stéphan）： 撰写、审稿与编辑、项目监督。赫林·皮埃尔（Hellin Pierre）： 撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据整理、概念构建。埃维拉特·艾伦（Everaert Ellen）： 撰写、审稿与编辑、验证、实验设计。德蒙蒂·伊丽莎白（Demonty Elisabeth）：
致谢 本项目由“瓦隆复兴计划”（Plan de relance de la Wallonie，简称PRW - Get up Wallonia）资助，用于CRA-W的VIROBETT项目（PRW 204/3，资助编号-D65-1429）。ILVO还获得了VLAIO-LA的VIRBICON项目（VLAIO-LA，资助编号HBC.2021.1048）的支持。作者感谢Wulf Menzel（DSMZ，布伦瑞克）、William M. Wintermantel（USDA-ARS，萨利纳斯）、Tetsuo Tamada（长沼农业研究所，北海道）和Naoto Yoshida（长沼农业研究所，北海道）的支持。
