《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：After Traumatic Brain Injury, EPHA4 Enhances Endoplasmic Reticulum Stress to Promote M1 Microglial Polarization Through the MAPK Signaling Pathway
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本文揭示了EPHA4在创伤性脑损伤（TBI）后通过激活MAPK信号通路增强内质网应激（ERS），进而促进小胶质细胞向促炎M1表型极化的新机制。研究表明，抑制EPHA4可有效缓解TBI后的神经炎症、血脑屏障损伤及脑组织水肿，为TBI的靶向治疗提供了潜在新策略。
背景
创伤性脑损伤（TBI）是全球范围内导致残疾和死亡的重要原因，其继发性损伤过程中的神经炎症与脑实质密切相关。小胶质细胞作为中枢神经系统的主要常驻免疫细胞，在TBI后的神经炎症调控中起关键作用。其中，促炎的M1型小胶质细胞在疾病进展中扮演重要角色，但调控其极化的具体机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨Ephrin受体A4（EPHA4）在TBI后小胶质细胞M1极化中的作用及机制。
材料与方法
通过控制性皮质撞击（CCI）法建立大鼠TBI模型，并使用脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞系GMI-R1的M1极化。通过转录组测序筛选TBI相关靶基因；采用实时定量PCR（RT-qPCR）、Western blot、ELISA和免疫荧光法检测关键基因及蛋白表达；通过苏木精-伊红（HE）染色和伊文思蓝染色评估大鼠脑组织损伤和血脑屏障（BBB）通透性。在体实验采用EPHA4抑制剂KYL肽干预，体外实验进一步使用EPHA4激活剂123C4、MAPK激活剂C16-PAF及ERS抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）进行机制验证。
结果
- 1.
EPHA4在TBI大鼠脑组织中高表达且与小胶质细胞活化相关
转录组测序显示TBI后大鼠脑组织中EPHA4表达上调。Western blot和RT-qPCR结果证实，TBI后第3天EPHA4的mRNA和蛋白表达达峰值。免疫荧光双标显示EPHA4与小胶质细胞标志物Iba1共定位增强，表明EPHA4与TBI后小胶质细胞活化相关。
- 2.
抑制EPHA4缓解TBI大鼠病理进展
与假手术组相比，TBI组大鼠脑组织含水量增加、BBB通透性升高、脑皮质结构破坏。而KYL肽干预后，脑组织水肿减轻、Evans蓝渗出减少、脑组织完整性得到改善，表明抑制EPHA4可有效延缓TBI进展。
- 3.
抑制EPHA4抑制小胶质细胞M1极化
ELISA检测显示，TBI后大鼠脑组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β1水平降低；KYL肽干预可逆转上述效应。Western blot及免疫荧光结果显示，TBI促进M1标志物iNOS、COX2、CD86表达，抑制M2标志物Arg1、CD206表达；而KYL肽处理后M1极化受到抑制，M2极化增强。
- 4.
EPHA4通过增强ERS促进M1极化
TBI后ERS相关蛋白（p-PERK/PERK、p-IRE1α/IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78）表达上调，细胞内Ca2+水平升高。KYL肽干预可降低ERS水平及Ca2+浓度。在LPS诱导的GMI-R1细胞中，EPHA4激活剂123C4进一步强化ERS并促进M1极化，而ERS抑制剂4-PBA可逆转该效应。
- 5.
EPHA4通过MAPK信号通路激活ERS
KEGG富集分析提示MAPK通路在TBI中显著激活。Western blot结果显示，TBI或LPS处理可升高p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-JNK/JNK水平，KYL肽干预则抑制MAPK通路活化。在机制上，MAPK激活剂C16-PAF可部分逆转KYL肽对ERS和M1极化的抑制作用，证实EPHA4通过MAPK/ERS轴调控小胶质细胞极化。
结论
本研究阐明了EPHA4在TBI后通过激活MAPK信号通路增强ERS，进而驱动小胶质细胞向M1表型极化的新机制。抑制EPHA4可有效缓解神经炎症及脑组织损伤，提示EPHA4/MAPK/ERS轴可能成为TBI治疗的潜在干预靶点。
