《Labour Economics》：Optimal Formalin-Fixed Paraffin Embedded Sample Preservation for Efficient Staining in Multiplex Imaging
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本研究通过比较室温、4°C、-20°C和-80°C储存条件下FFPE组织样本的免疫组化信号，发现室温储存超过6年导致显著信号衰减，尤其影响CD20、CD45等标记物。-20°C储存可有效稳定信号，建议回顾性研究优先使用≤6年样本块，并标准化保存流程以确保结果可重复。
尤娜·德拉鲁（Yuna Delarue）、娜德吉·马雷克（Nadège Marec）、玛丽昂·勒罗谢（Marion Le Rochais）、克里斯特尔·勒丹泰克（Christelle Le Dantec）、索伊齐克·加拉德（Soizic Garaud）、阿诺·乌根（Arnaud Uguen）、迪维·科尔内克（Divi Cornec）、克里斯托夫·贾明（Christophe Jamin）、皮埃尔·波沙尔（Pierre Pochard）、帕特里斯·埃蒙（Patrice Hemon）
法国布列斯特大学医院（CHU de Brest, Brest, France）
摘要
免疫组化技术的准确性在很大程度上取决于组织样本中抗原完整性的保持。尽管通常使用福尔马林固定、石蜡包埋的组织进行长期储存，但多项研究表明随着时间的推移信号会逐渐减弱。然而，这种减弱程度以及储存条件对多种标记物的影响仍不明确。在这项研究中，分析了在八年期间收集的组织块以及在不同条件下（室温、4°C、-20°C、-80°C）储存的组织切片。使用了25种针对免疫细胞、基质细胞和结构标记物的抗体来染色四种不同的组织切片。样品通过成像质谱细胞术（IMC）进行采集。首先量化信号强度，然后使用imcRtools流程对数据进行前后标准化处理。结果显示，在室温下储存超过六年的组织块中，信号强度逐渐减弱，影响了某些标记物的检测，无论组织类型如何。对于某些切片，即使在室温下仅储存一周后也观察到显著的信号减弱；而对于其他切片，则是在储存一个月后。CD20、CD45和CD45RA等标记物尤为敏感。在-20°C或-80°C下储存能够保持染色的质量，而在4°C下储存只能部分保持。标准化处理纠正了一些变异，但无法恢复严重改变或完全消失的信号。常见的室温储存方法会导致IMC检测到的免疫反应性逐渐降低，这可能影响科学解释和诊断结果。因此，在-20°C下储存是一种有效且可行的解决方案。对于回顾性研究，我们建议使用储存时间不超过六年的组织块。总体而言，这些结果强调了建立标准化保存协议的重要性，以确保分析结果的可重复性。
引言
近年来，组织学领域取得了重大进展，包括成像质谱细胞术（IMC）。多重成像技术的发展带来了多种新型技术，每种技术都有其优缺点（1）。随着这些方法的复杂性增加，在免疫染色的每一步都需要特别小心，因为这些高度复杂的技术依赖于信号强度的检测。其中一个关键步骤是组织保存，它可能会影响免疫染色的稳定性。现有的标准化算法可以在一定程度上减少信号变异，但无法完全消除变异（2）（3）（4）。
样品通常采用石蜡包埋，这是目前保存组织数年的最佳方法，对于患者随访和科学研究（尤其是回顾性研究）至关重要。另一种方法是冷冻保存，适用于某些特定检测，如即时检查（5）或荧光原位杂交（6）。然而，这种方法需要较大的空间（深冻柜），且不环保；而石蜡包埋工艺能够较好地保持组织形态（7）。不同国家的储存规定可能有所不同，例如在美国和英国，组织块和切片的保存期限为10年，而在印度则根据采集中心的不同可延长至25年（8）。多项研究表明，将组织切片长期保存在室温下会导致免疫原性显著降低或丧失（9）（10），从而可能导致假阴性结果（11）（12）（13）。IMC检测到的免疫反应性逐渐减弱可能是由于抗原的光氧化或所使用的干燥方法（14）。所有这些研究仅评估了储存时间对少数标记物的影响，但对于IMC或其他类似方法所实现的高度多重免疫染色来说，其影响仍不清楚。
本研究的目的是确定最佳的储存条件，以确保使用石蜡包埋组织进行长期分析时，能够获得可靠且稳定的IMC染色结果。
实验部分
生物材料
本研究使用的所有组织样本均来自法国布列斯特大学医院病理学部门的组织块收藏。所有样本均按照机构规程使用4%缓冲福尔马林进行固定，并在标准化条件下进行石蜡包埋处理。福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）后的组织切片厚度为4微米，随后将其固定在Superfrost? Plus载玻片上（Thermo Scientific, Saint-Herblain, France），并干燥2小时
结果
本研究设计了包含25种标记物的检测组合，包括表面标记物和细胞内标记物、细胞因子及其受体，以及常用的结构标记物（如I型胶原（ColT1）、α-平滑肌肌动蛋白（SMA）等，并验证了这些标记物适用于IMC检测（表1）。该组合包含表面标记物CD4和CD3，以及细胞内标记物（如细胞因子），已有研究显示这些标记物的表达可能受储存时间的影响
讨论
将石蜡包埋的组织块保存在室温下被认为是最简单的方法，可以保证使用IMC等技术分析蛋白质表达时的稳定性。所有样本均按照标准化条件（福尔马林固定和石蜡包埋）进行固定和处理，我们认识到偏离这些参数可能会影响抗原的保存。尽管对于大多数标记物来说这一点是可以验证的，但对于
作者贡献：
P.H.和Y.D.负责研究概念的提出、方法的设计与开发；P.H.和Y.D.负责数据的采集、分析和解释以及统计分析；M.L.R.和A.U.提供了技术和材料支持。Y.D.、N.M.、M.L.R.、S.G.、A.U.、C.J.和P.H.参与了论文的撰写、审阅和修改；所有作者均阅读并批准了最终版本。
利益冲突声明
作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
致谢
作者感谢法国布列斯特的Hyperion细胞术流式检测设施提供的技术支持，以及欧洲FEDER项目Progos RU（科学兴趣小组GIS的成员）Biogenouest的支持。
