氧诱导视网膜病变中阶段相关小胶质细胞亚群的动态特征及其在血管生成与消退中的作用机制

《Cell Proliferation》：Stage-Associated Microglial Subpopulations and Dynamics in Vascular Pathogenesis of Oxygen-Induced Retinopathy

本综述深入探讨了氧诱导视网膜病变（OIR）模型中视网膜新生血管（RNV）形成与自发消退两个阶段内，小胶质细胞的时空动态、分子异质性及功能差异。研究揭示了高糖酵解小胶质细胞（HGM）通过高表达丙酮酸激酶M2（Pkm2）驱动RNV形成，而消退期则出现以甘露糖受体C型1（Mrc1/CD206）为标志、具有增强吞噬活性的吞噬相关小胶质细胞（PAM）亚群。这些发现为理解RNV（如早产儿视网膜病变ROP、糖尿病视网膜病变PDR）的发病机制及开发阶段特异性干预策略提供了新视角。

　　

1 引言

视网膜新生血管（RNV）是多种致盲性眼病的共同病理特征。尽管抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法广泛应用，但其局限性凸显了深入探索RNV发病机制的必要性。小胶质细胞作为视网膜常驻免疫细胞，在血管发育和病理性血管生成中发挥关键作用。然而，对其在RNV自发消退阶段的行为和功能知之甚少。本研究旨在全面揭示小胶质细胞在RNV形成和消退全过程中的时空动态和分子异质性。

2 结果

2.1 小胶质细胞的迁移与归巢与RNV形成和消退同步

在OIR模型中，研究发现小胶质细胞在RNV形成期表现出从外层到内层、从中央到中周部的迁移模式，而在消退期则呈现反向迁移趋势。在中央视网膜，RNV形成期（P17前）外丛状层（OPL）小胶质细胞显著减少，而内核层（INL）小胶质细胞比例暂时升高。消退期（P17后），神经节细胞层（GCL）和内丛状层（IPL）的小胶质细胞略有减少，INL的小胶质细胞增加，同时OPL的小胶质细胞数量恢复至接近正常水平。视网膜铺片结果进一步证实，在RNV高峰期（P17），小胶质细胞在浅层血管丛（约GCL）聚集，而在深层血管丛（约OPL）则显著减少。这些数据共同提示了小胶质细胞在RNV进展中存在以由外向内为主的迁移，并在消退期发生反向归巢。

2.2 视网膜铺片三维分析揭示中央至中周部的小胶质细胞动态

对全视网膜小胶质细胞密度的分析发现，OIR视网膜在RNV高峰期（P17）的浅层血管丛，其中央和中周部区域的小胶质细胞密度显著增加，而外周区域变化不大。定量分析显示，中周部浅层视网膜是小胶质细胞动态变化最显著的区域。

2.3 通过scRNA-seq鉴定NOX和OIR小鼠视网膜中的小胶质细胞亚群

通过单细胞RNA测序（scRNA-seq），研究从OIR和对照（NOX）小鼠视网膜中鉴定出8个CD11b⁺细胞亚群，其中6个为小胶质细胞亚群：静息小胶质细胞（MG0）、迁移相关小胶质细胞1和2（MAM1, MAM2）、吞噬相关小胶质细胞（PAM）、神经退行性变相关小胶质细胞（NAM）和高糖酵解小胶质细胞（HGM）。PAM特异性表达_Mrc1，NAM高表达_Vldlr，而HGM则高表达糖酵解相关基因如_Lgals3、_Pkm等。

2.4 新生血管形成和消退过程中的阶段性小胶质细胞轨迹

RNA速率分析揭示了小胶质细胞亚群间动态转变的阶段特异性。在RNV形成高峰的P17期，OIR组小胶质细胞表现出从MAM1到MG0，再到HGM的转变轨迹，HGM比例增加。而在消退期的P21期，转变轨迹变为从PAM到MG0，部分MG0进一步转向NAM，PAM和NAM的比例在OIR组显著升高。

2.5 HGM的糖酵解对于新生血管形成至关重要

HGM在P17期高表达经典M1和M2状态的部分标志物，提示其可能是一种中间状态。与MG0相比，HGM中糖酵解通路相关基因显著上调，特别是编码关键限速酶的_Pkm2基因。免疫荧光染色证实OIR视网膜中Pkm2⁺/F4/80⁺双阳性小胶质细胞增多。体外实验表明，缺氧培养的BV2小胶质细胞（模拟HGM状态）上清液能促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）成管，此效应可被Pkm2抑制剂化合物3k削弱。更重要的是，在小胶质细胞中特异性条件性敲除_Pkm2（_Pkm2^CKO）可显著减轻OIR小鼠的病理性视网膜新生血管面积。这些结果强有力地表明高糖酵解的HGM是驱动RNV的关键因素。

2.6 PAM与新生血管消退相关

在RNV消退期（P21），OIR组的PAM亚群比例显著增加。基因本体（GO）富集分析显示，OIR PAM中上调的基因显著富集于吞噬作用和内吞作用等相关通路。单细胞水平上，OIR PAM的吞噬相关基因（如_Apoe, _Lyz2, _Mrc1）表达升高。组织学上，在P21 OIR视网膜中可观察到小胶质细胞胞体内存在CD31⁺的内皮细胞碎片，表明其吞噬活性增强。免疫组织化学染色进一步证实，在P21 OIR视网膜中周部新生血管消退区域，有大量Mrc1/CD206⁺Iba1⁺的双阳性小胶质细胞（即PAM）聚集，而在血管相对健康的外周区则很少见。这支持了PAM在病理性血管清除和重塑中的积极作用。

3 讨论

本研究通过细致的时空采样和单细胞测序分析，全面描绘了OIR模型中与小胶质细胞相关的RNV形成和消退阶段的动态变化。研究不仅证实了HGM在RNV形成中的促进作用，并确定Pkm2是其关键效应分子，还首次鉴定出在消退期特异性出现、具有增强吞噬活性的PAM亚群。RNA速率分析揭示了小胶质细胞亚群间存在阶段依赖性的重编程轨迹。这些发现深化了对小胶质细胞在RNV中复杂作用的理解，揭示了其功能具有阶段特异性（有害或有益），为开发针对RNV不同病理阶段的特异性治疗策略提供了新的见解和潜在靶点。

4 材料与方法

（此部分为实验方法细节，包括小鼠模型构建、视网膜切片与铺片、免疫荧光、单细胞RNA测序、RNA速率分析、细胞实验、Western blotting、统计学分析等具体技术流程和参数，此处遵循要求不予详细展开归纳。）