《Environmental Microbiology Reports》：Escherichia Species Diversity Across Pristine and Impacted Catchments: Evidence for Avian Sources of Escherichia marmotae in Aotearoa/New Zealand
摘要
研究团队在新西兰（Aotearoa）选取了五个原始（原生森林）和五个受干扰（牧场或城市）地点，从水、土壤、沉积物、生物膜和粪便样本（n=413）中分离出1347株Escherichia菌株，并将其细分为E. coli系统型和非E. coli Escherichia物种（包括Escherichia marmotae, Escherichia ruysiae 和 Escherichia whittamii）。研究发现，受干扰地点的水、生物膜、沉积物和哺乳动物粪便中，E. coli的流行率更高，尤其是与反刍动物相关的B1系统型。相比之下，E. marmotae（189株分离株）在原始地点和鸟类粪便中更为常见，流行率达28.7%。对高变基因gnd的代谢条形码分析进一步揭示，水生环境（水、沉积物、生物膜）中的Escherichia种群多样性最高。Escherichia种群多样性还与淡水E. coli浓度升高、致病性E. coli毒力因子（stx1, stx2和 eae）流行率增加以及牲畜数量增多相关。相反，鸟类粪便和土壤样本，以及来自粪便来源较少的原始地点的样本，其Escherichia种群多样性指标最低。这些发现突显了鸟类作为E. marmotae储存库的生态作用及其对新西兰淡水生态系统微生物多样性的贡献。
1 引言
Escherichia coli是哺乳动物和鸟类胃肠道中的常见居民，但它也经常在环境环境中持续存在，反映了其在肠道外栖息地的适应性。因此，通常使用E. coli作为粪便来源的指示菌和粪便源性其他微生物病原体（如Salmonella, Campylobacter, Cryptosporidium 和产志贺毒素大肠杆菌（STEC））的替代指标，来监测水传播污染和人类健康风险。然而，越来越多的证据挑战了E. coli仅是近期粪便污染指示菌的长期观点。研究表明，在人类或牲畜直接输入极少或没有的原始环境中，E. coli也存在持久性和明显的自然化现象。
受废水处理厂点源排放影响的城市淡水点以及具有农业地表径流的牧场点，通常显示出较高的源自粪便的E. coli浓度。相比之下，受人类或牲畜影响最小的原生栖息地E. coli负荷较低，为在粪便输入减少的环境中研究环境E. coli种群提供了机会。
高分辨率全基因组测序（WGS）方法为E. coli系统发育提供了新见解，通过分型鉴定出至少八个具有特征性宿主和生态位的不同系统型，为可能的粪便来源提供了线索。例如，系统型B1通常与反刍动物胃肠道相关，指示近期粪便污染事件。相反，系统型B2更常从肠道外栖息地（如尿路感染（UTI）病原体）中分离出来，并且在粪便来源较少的森林栖息地中发现。初步证据还表明，淡水E. coli浓度升高与E. coli多样性增加相关，这是由于牲畜或城市地区的扩散性粪便污染所致。
E. coli的系统发育分析还揭示了隐秘支系（I至V）的存在，这些E. coli样细菌通过常规培养或水质评估方法无法区分，但使用WGS数据可以轻松分离。支系I由于其与典型E. coli菌株的基因组相似性，通常被视为严格意义上的E. coli，而其他支系已被指定物种名称：支系II为Escherichia whittamii；支系III和IV为Escherichia ruysiae；支系V为Escherichia marmotae。这些非E. coli Escherichia物种偶尔从临床病例中分离出来，常见于免疫功能低下患者和健康个体，毒力较低，但主要从环境和野生动物来源中报道。初步研究表明，它们在粪便来源多样的地点稀少，并且在鸟类中的存在反映了其作为溢出宿主的短暂通过，而非肠道定植。尽管它们被描述为新出现的人类病原体，但非E. coli Escherichia物种的环境生态位和起源仍不确定，并且由于与人类和牲畜粪便来源的关联较弱，它们作为人类健康风险的指示菌效果不佳。因此，它们在淡水风险评估中作为其他病原体指示菌的相关性仍不明确。
新西兰（NZ）景观缺乏地方性陆生哺乳动物物种，为检查具有不同粪便来源和负荷地点的环境样本提供了独特机会。为减少引入的害虫和捕食者以支持地方物种种群而进行密集管理的灌木丛保护区，提供了无哺乳动物的理想采样地点。然而，牧区和城市景观代表了受相对较高粪便负荷和来自动物和人类的多种（通常是扩散性）粪便来源影响的地点。
2 实验方法
2.1 采样点详情
在16个月的研究期间（2020年2月至2021年6月），对十个野外地点（五对配对位置）进行了六次采样，每个点对在12个月内完成采样。配对地点选择覆盖新西兰南北岛，优先考虑可在采集后24小时内完成采样和处理的可进入保护区。奇数编号地点（'保护区' Site01至09）位于进行密集管理以根除引入的捕食性害虫物种（鼬科动物、负鼠、刺猬和啮齿动物）的原始保护区内，旨在增强本地生物多样性，特别是地方性鸟类。偶数编号地点（'受干扰' Site02至10）位于牧区农场（Site02, 04, 08, 10）和一个城市环境（Site06）中。每个保护区-受干扰点对之间的线性距离从20.9公里（Site01和02之间）到1.01公里（Site09和10之间）不等。
2.2 环境采样与细菌回收
在每个地点采集水、沉积物、土壤、水生生物膜（附生藻类）和机会性鸟类及哺乳动物粪便样本。使用Colilert-18和Quanti-Tray/2000对水样（100 mL）中的E. coli进行计数，并在35°C下培养（18至21小时）以回收应激细胞，确定每100 mL的大肠菌最大可能数（MPN）。从环境样本中回收单个分离株并使用先前描述的方法进行DNA储存。
2.3 分离株的分子分析与分型
通过PCR扩增284 bp的部分gnd序列并进行Sanger测序。使用定制的gndDb参考数据库（包含从基因组序列数据获得的766个不同的284 bp gnd序列）鉴定每个E. coli分离株的gnd序列类型（gST）。使用先前描述的PCR引物和条件鉴定E. coli系统型和非E. coli物种。
2.4 使用实时PCR鉴定stx1, stx2和eae毒力因子
使用实时（RT-）PCR确定致泻性E. coli毒力因子（志贺毒素1（stx1）、志贺毒素2（stx2）和上皮细胞粘附因子紧密素（eae））的流行率。使用样品富集后的洗涤煮沸裂解液检查每个毒力因子的存在/缺失。
2.5 Escherichia spp. gnd代谢条形码
对于Escherichia群落分析，使用索引化的2gndF和2gndR PCR引物从洗涤煮沸裂解液中扩增gnd基因的284 bp区域。将单独索引的PCR产物混合创建文库混合物，在Illumina MiSeq（v.2化学）平台上进行2×250 bp双末端测序。使用DADA2软件包分析gnd代谢条形码序列读数，构建扩增子序列变异（ASV）表。将单个ASV（与gST同义）映射到gndDb数据库，以提供与单个样品富集相关的Escherichia群落谱信息。
2.6 代谢条形码数据分析和Escherichia spp.多样性
将ASV表、样本元数据和匹配的gST表组合，使用R包Phyloseq构建phyloseq对象。使用vegan R包计算Chao1和Shannon alpha多样性指标、betadispersion和rarefaction分析。在R中使用包括ggpubr和ggplot2在内的多种包进行数据可视化。使用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR < 0.05）调整样本类型或土地利用与Escherichia种群alpha多样性 pairwise比较的显著性水平。使用networkD3生成Sankey图，其中通过排除Site、Sample、gST频率≤4的三元组合来去除稀有gST。使用对数10转换的计数（log10(reads+1)）的主成分分析（PCA）来识别样本类型和保护区/受干扰地点水平的人口趋势。
2.7 使用基于回归模型的数据分析
使用广义线性混合模型（GLMMs）、广义线性模型（GLMs）和线性混合效应模型（LMEs）来研究细菌特征（如系统型/Escherichia spp.）流行率与stx1, stx2, eae基因存在（即样品富集是否使用Cq< 35.0为阳性）以及环境变量（如样本类型、土地利用、E. coli log10MPN浓度等）在样本和分离株水平上的关联。
2.8 景观测绘与流域特征
从土地覆盖数据库v.5.0检索土地覆盖数据，从河流环境分类2（REC2）检索河流数据，使用Jupyter内的ipyleaflet和Python v.3.9脚本。根据土地利用和碳分析系统（LUCAS）的放牧数据确定反刍牲畜数量，以根据土地利用计算饲养密度。
地点流域的总面积从38.9到约19,000公顷不等，流域长度介于0.1到超过86公里之间。作为总面积度量，草场范围约为7.16%–78.0%，受干扰流域的牲畜以羊为主（38.8%–96.0%）。尽管保护区地点被选择为样本点流域内无牲畜，但LUCAS数据表明Site03（n=35；据当地知识，保护区外相邻上游围场有肉牛和羊存在）和Site07（n=65；采样访问期间未观察到牲畜）存在有限的牲畜。
3 结果
3.1 从环境样本中分离Escherichia spp.
在完整的16个月采样期内，总共进行了60次地点访问，10个地点（5对保护区-受干扰对）分别访问了6次。总共收集了53个生物膜、60个土壤、58个沉积物和60个水样，以及182个机会性粪便样本（160个鸟类和22个哺乳动物）。由于缺乏或微生物生长不良，3个生物膜、8个沉积物、22个土壤、8个水和30个（29个鸟类，1个牛）粪便样本未获得Escherichia spp.分离株。
从所有地点和大多数样本（413个中的342个，82.8%）中分离出Escherichia。保护区地点占未获得E. coli分离株的样本的大部分（71个中的63个，88.7%）。淡水E. coli计数的几何平均值从每100毫升2个E. coli MPN（Site01, Pūkaha）到1091个E. coli MPN每100毫升（Site02, Hamua）不等，受干扰地点的淡水E. coli浓度高于其配对的上游保护区地点。
3.2 跨样本类型和土地利用的Escherichia spp.系统分型和流行率
在60次采样访问中，从10个地点分离出1351个推测的Escherichia。对剩余的1347个分离株进行了PCR系统分型。无法使用常规PCR对24个分离株（1.78%）进行系统分型鉴定。系统型B1（37.7%, n=508）和B2（18.1%, n=244）是最常见的系统型。鉴定出四个隐秘支系，包括E. coli相关的支系I（0.07%, n=1），支系II/E. whittamii（0.15%, n=2），支系III/IV/E. ruysiae（0.74%, n=10）和支系V/E. marmotae（21.4%, n=289）。
以鸟类粪便为参考，非E. coli Escherichia spp.的样本水平流行率在沉积物和土壤中较低，但与水相比无差异。通用E. coli的样本水平流行率在土壤中较低，但在生物膜、沉积物和水样中高于鸟类粪便。
在系统型/Escherichia物种水平上，样本类型多种多样，尽管未从哺乳动物粪便中分离出非E. coli Escherichia spp.。与鸟类粪便相比，系统型B1更普遍存在于水、生物膜、沉积物和哺乳动物粪便样本中。系统型C（与B1系统发育关系最接近）显示出类似的环境样本流行特征。与鸟类粪便相比，所有其他环境样本类型显示E. marmotae流行率较低，但差异无统计学意义。
将地点分类为“保护区”和“受干扰”时，与受干扰地点相比，保护区样本对通用E. coli呈阳性的可能性较低，但非E. coli Escherichia spp.样本流行率在“保护区”和“受干扰”地点之间无差异。
系统型B1和B2以及E. marmotae是从每个地点分离的主要类型。在个体地点水平，B1是受干扰地点最流行的系统型，而E. marmotae是保护区地点最流行的Escherichia物种。当以“受干扰”为参考检查“土地利用”作为固定效应时，系统型B1在“保护区”地点流行率较低。系统型B2的流行率在不同土地利用间无差异，但系统型C和E在“保护区”地点流行率较低。E. marmotae在“保护区”地点更流行。关于E. coli浓度与系统型的关系，随着log10MPN增加，仅检测系统发育群B1的几率增加。
3.3 使用gnd序列类型对Escherichia spp.进行分子分型
针对高变gnd基因的284 bp片段进行细菌分型，将1347个分离株分为264个不同的gnd序列类型（gST），并映射到gndDb参考数据库中的参考序列。大多数gST（90.8%，262个中的238个）与E. coli系统型（A到G）相关，其余24个（9.2%）与非E. coli Escherichia spp.相关（22个E. marmotae，1个E. ruysiae和1个E. whittamii）。总体而言，gST514（n=46）、gST258（n=45）和gST587（n=38）是从最多样本中分离出来的，83个gST（31.7%）是仅分离一次的单一型。平均而言，从五个受干扰地点分离出76个gST，而从五个保护区地点分离出35个gST，与来自非E. coli Escherichia spp.的gST相比，来自受干扰地点的E. coli gST具有更高的相对丰度。
3.4 使用gnd代谢条形码进行Escherichia spp.群落分析
从326个样本（>1000次读数）中总共获得656万条读数，平均每个文库20,127次读数，映射到参考gnd序列（gndDb）。从所有地点和大多数样本中获得了带条形码的gnd扩增子。总共识别出1303个不同的ASV，平均每个环境样本有29个ASV，从一个水样（Site06）中识别出最多253个独立的ASV。稀疏曲线表明扩增子测序深度足以准确估计ASV丰富度。通过将ASV映射到gndDb参考数据库，将ASV分为四组：匹配gndDb数据库中gST的ASV；仅匹配gndDb中非E. coli Escherichia物种gnd序列的ASV；匹配gndDb中E. coli和非E. coli Escherichia物种gnd序列的ASV；以及来自其他肠杆菌科且与gndDb不匹配的剩余gnd ASV。大多数读数（72.9%）匹配E. coli gnd序列。
在Escherichia群落分析中，读取水平相对丰度最高的gST是gST514（4.04%），在所有10个地点的粪便、水、生物膜、沉积物和土壤样本中发现，并匹配gndDb中对应的E. coli gST。第二丰富的gST是gST587（2.7%），是gndDb中对应E. marmotae的gST，同样在所有10个地点发现。包括gST587在内，从gnd代谢条形码测序数据中鉴定出25个gST， specifically代表19个E. marmotae，5个E. ruysiae（支系III和IV）和1个E. whittamii（支系II）。总体而言，从67.5%的样本中鉴定出非E. coli Escherichia物种相关的gST。
3.5 gnd序列类型的Alpha和Beta多样性
总体而言，与Site01（保护区参考点）相比，受干扰地点所有匹配E. coli和Escherichia物种（E. marmotae, E. ruysiae 和 E. whittamii）的gnd序列类型（gSTs）（n=416）的alpha多样性测量值显著更高。个体受干扰地点（Site02, Site04, Site06, Site08和Site10）的gST丰富度（Chao1）测量值随着它们之间线性距离的增加而增加。与水、生物膜、沉积物和哺乳动物粪便相比，鸟类粪便和土壤样本的丰富度和样本内种群多样性（Shannon指数）降低。
仅针对非E. coli Escherichia物种（E. marmotae, E. ruysiae 和 E. whittamii）（n=25）的gST丰富度，对于Site06, Site07, Site08和Site10，与Site01相比有所增加。同样，与Site01相比，仅Site08的平均Shannon多样性指数有所增加。与鸟类粪便相比，哺乳动物粪便中非E. coli Escherichia物种gST的丰富度和Shannon多样性降低，表明利用代谢条形码检测方法，水、生物膜和沉积物这些“汇”来源中的gST多样性增加。
随后的PCA检查了来自每个相应文库（n=326）的所有E. coli和非E. coli Escherichia物种gST（n=416）的样本库之间的群落多样性，证实了与下游具有牧区或城市作为主要土地利用类别的相应配对地点相比，低影响保护区地点的样本gnd-扩增子群落之间的β多样性降低的证据。同样，样本间变异表明，与鸟类和哺乳动物粪便以及土壤相比，水、沉积物和生物膜具有更高的β多样性。
3.6 跨样本类型和土地利用的致泻性E. coli毒力因子流行率
使用实时PCR（RT-PCR）从409个煮沸裂解样品富集中鉴定stx1, stx2和eae基因的存在。eae在35.2%（409个中的144个）的DNA制备中检测到，stx2在23.7%（n=97）中检测到，stx1在6.8%（n=28）中检测到。毒力基因最常在哺乳动物粪便中检测到，而在土壤中检测频率最低。
广义线性混合模型使用RT-PCR数据确定stx1, stx2和eae毒力因子的存在或缺失表明，与鸟类粪便相比，stx1在哺乳动物粪便和水中更流行。stx2与哺乳动物粪便、生物膜和沉积物更相关，而eae在生物膜和水中更流行，但在土壤中流行率较低。与“受干扰”地点相比，所有三种毒力因子在“保护区”地点的流行率都低得多。
stx1, stx2和eae基因也随着E. coli浓度（log10MPN）的增加、受干扰地点以及匹配gndDb中gST的代谢条形码数据相关的alpha多样性指标（丰富度，Shannon指数）的增加而更常被检测到。系统型B1在stx1和eae阳性样本中更常检测到，而系统型B2与stx2负相关。E. marmotae阳性样本与stx1, stx2或eae基因之间没有交互作用。
4 讨论
本研究旨在结合基于培养和代谢条形码的方法，来表征不同土地利用环境下非E. coli Escherichia群落及其潜在来源。研究试图确定这些物种是否在粪便输入极少的低影响灌木丛保护区更普遍，从而可能作为生态系统健康的指标，并与受城市和/或牧区活动影响的下游地点形成对比。
新西兰缺乏地方性陆生哺乳动物物种，为比较具有不同粪便来源地点的Escherichia群落结构提供了独特机会，重点关注E. coli作为来自对比土地利用地点的粪便指示菌。本研究的保护区地点是原始森林环境，经过精心管理，引入了害虫和捕食者，牲畜粪便来源可忽略不计。
与受干扰的下游地点相比，本研究的保护区地点淡水E. coli浓度较低。然而，即使是上游集水区数量较少的牲畜，也与E. coli log10MPN增加一个数量级、反刍动物相关的系统型B1流行率增加以及E. marmotae流行率降低相关。这些数据清楚地表明，来自保护区上游的牲畜污染导致粪便来源增加和系统型B1水平升高。
值得注意的是，Site06是唯一一个上游牲畜影响最小的城市地点，系统型B1水平较低，但E. marmotae流行率较高。这些数据表明，在没有主要牲畜输入的情况下，鸟类可能代表一个重要且一致的粪便来源，而不是偶然携带者。
系统型B2在原始和受干扰地点均有检测到。先前的研究已将系统型B2与低影响环境联系起来，然而，在靠近原始区域的某些受干扰地点观察到B2流行率增加，表明潜在的环境连通性或来自上游来源的扩散。
非E. coli Escherichia spp.作为机会性病原体的潜在作用仍不确定。然而，越来越多的证据表明，非E. coli Escherichia spp.可能获得含有抗菌素耐药性基因的质粒，结合质粒相关毒力基因，可能增强致病性并发展为新兴病原体。
除了识别毒力因子，表征非E. coli Escherichia spp.的生态栖息地对于水传播风险评估、评估其对人类健康的直接风险以及评估它们作为粪便污染间接健康风险指示菌的效用至关重要。非E. coli Escherichia spp.，尤其是E. marmotae，最常从保护区地点的鸟类粪便中分离出来，表明与通用E. coli相比具有独特的生态学。然而，这种在鸟类宿主中E. marmotae的优势是受个体宿主特异性、增强的环境持久性还是减少与受干扰地点相关的更多样化粪便来源的E. coli竞争的影响需要进一步研究。
使用代谢条形码方法，本研究中鸟类粪便和土壤样本中的Escherichia spp.多样性低于肠道外水生环境生态位类型（水、沉积物、生物膜）。这种较低的Escherichia spp.总体多样性可能有助于从鸟类粪便中分离非E. coli Escherichia物种的频率更高，特别是如果鸟类是首选宿主。
本研究是迄今为止最全面的研究，旨在识别非E. coli Escherichia spp.的潜在来源和宿主，并揭示来自不同土地利用环境样本的Escherichia spp.群落多样性。研究结果指出了E. marmotae和E. coli的不同栖息地，鸟类是新西兰丛林环境中E. marmotae的可能宿主。在牲畜粪便输入低的地点一致检测到非E. coli Escherichia物种，特别是E. marmotae，支持鸟类作为主要储存库和环境传播的可能来源的推论，而不是环境暴露的被动接受者。此外，通过识别非E. coli Escherichia物种作为低影响地点和生态完整性的潜在标志物，这项研究有助于开发淡水生态系统健康的微生物指标。
