《FASEB BioAdvances》：Diabetes Induces Accumulation of Carbonylated Proteins in the Rat Retinal Pigment Epithelium Independently of Oxidative Stress
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本文聚焦糖尿病视网膜病变（DR）早期阶段，研究发现链脲佐菌素（STZ）诱导的短期高血糖可导致大鼠视网膜色素上皮（RPE）出现羰基化蛋白显著积累及脂质过氧化增强，但关键的抗氧化防御系统（如Nrf2表达、总谷胱甘肽（GSH）和还原型谷胱甘肽水平、Na+/K+-ATPase活性）却维持稳定，且抗氧化剂槲皮素（Quercetin）和一氧化氮合酶（NOS）抑制剂L-NAME未能逆转蛋白氧化。这表明糖尿病早期RPE损伤可能源于蛋白降解机制紊乱或未折叠蛋白反应（UPR），而非经典氧化应激通路，为DR发病机制提供了新视角。
引言
糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy, DR）是糖尿病（Diabetes Mellitus）的主要并发症，以高血糖（Hyperglycemia）导致的微血管损伤和视网膜神经功能障碍为特征。作为血-视网膜屏障（Blood-Retinal Barrier, BRB）的关键组成部分，视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium, RPE）在调节脉络膜血流与视网膜外层之间的代谢物和离子流动、支持光感受器功能方面扮演核心角色。因此，RPE功能障碍可导致视网膜损伤。尽管多种代谢通路包括氧化/硝化应激（Oxidative/Nitrosative Stress）被证实参与DR发展，但其确切机制尚不明确。
材料与方法
研究使用雌性Long-Evans大鼠，通过单次腹腔注射链脲佐菌素（STZ, 98 mg/kg）诱导糖尿病模型。动物分为12组，包括对照组、不同糖尿病病程组（7天、20天、45天）及分别接受槲皮素（QE, 10 mg/kg）或L-NAME（50 mg/kg）干预的组别。检测指标包括：通过OxyBlot试剂盒分析羰基化蛋白水平；测定脂质过氧化产物共轭二烯（Conjugated Dienes, CD）含量；评估超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性、抗坏血酸（Ascorbic Acid）含量、总谷胱甘肽（GSH）及还原型谷胱甘肽水平；采用Western Blot检测核因子E2相关因子2（Nrf2）表达；通过免疫组化观察紧密连接蛋白ZO-1分布；并测定Na+/K+-ATPase活性。数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析及Tukey事后检验进行统计学分析。
结果
代谢参数与氧化损伤标志物
糖尿病模型成功建立，表现为血糖及糖化血红蛋白（HbA1c）显著升高（STZ 45天组：血糖453±40 mg/dL, HbA1c 10.70±0.58%），且QE或L-NAME处理未改变高血糖状态。正常大鼠RPE即存在较高水平羰基化蛋白，STZ诱导20天和45天后，该水平均增加约一倍。值得注意的是，QE或L-NAME干预均未显著改变羰基化蛋白积累程度。脂质过氧化水平（以CD衡量）在正常RPE中较高（30±13 nmol/mg蛋白），糖尿病45天时显著增加60%。同时，抗坏血酸含量在糖尿病45天时下降50%。
抗氧化防御系统反应
SOD活性在糖尿病45天时显著增加约一倍（达198±9%相对于正常值）。然而，总GSH水平（正常值179±40 nmol/mg蛋白）及氧化型谷胱甘肽（GSSG）比例（约5%）在糖尿病各阶段均无显著变化。Nrf2蛋白表达（检测到68-70 kDa和100 kDa两条带）在糖尿病条件下虽有升高趋势，但无统计学差异。Na+/K+-ATPase活性在整个研究期间亦未发生显著改变。
RPE结构完整性变化
尽管关键生化指标相对稳定，ZO-1免疫组化显示，糖尿病20天时RPE细胞呈现六边形结构紊乱、细胞间连接中断及细胞丢失，提示细胞间相互作用受损。
讨论
本研究揭示了糖尿病早期RPE的一种独特反应模式：在高血糖条件下，RPE虽出现蛋白羰基化积累和晚期脂质过氧化增强，但其核心抗氧化防御能力（通过SOD活性代偿性升高、GSH稳态维持及Nrf2通路未激活得以体现）和Na+/K+-ATPase功能仍保持稳定。羰基化蛋白积累未被QE或L-NAME逆转，提示该过程可能独立于经典氧化应激和硝化应激通路。相反，蛋白氧化更可能与蛋白质降解机制障碍或内质网未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）激活相关。ZO-1分布异常则表明高血糖可能直接损害细胞连接结构，影响外血-视网膜屏障功能。综上，糖尿病早期RPE损伤可能主要由蛋白质稳态失衡而非氧化应激驱动，这为理解DR发病机制及寻找新的干预靶点提供了重要线索。
