《The FASEB Journal》：UFMylation at the Crossroads of Health and Cancer: A Blessing in Disguise
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本综述系统阐述了新兴的类泛素化修饰——UFMylation的酶学机制、细胞功能及其在癌症中的双重作用。文章重点解析了UFM1（Ubiquitin-fold modifier 1）通过E1（UBA5）、E2（UFC1）、E3（UFL1/UFBP1/CDK5RAP3复合体）级联反应修饰底物的独特生化特性，及其在内质网稳态、核糖体质量控制（RQC）、DNA损伤应答（DDR）和免疫调节中的核心功能。作者深入探讨了UFMylation通路关键组分在多种癌症（如胃癌、肝癌、乳腺癌）中的表达异常及促癌/抑癌双重角色，并展望了靶向该通路（如开发UBA5抑制剂）的癌症治疗新策略。
1 引言
泛素（Ubiquitin）和泛素样蛋白（UBLs）修饰是最常见的蛋白质翻译后修饰（PTMs）之一，与磷酸化、糖基化、乙酰化等共同精细调控蛋白质的命运。UFMylation作为一种新兴的UBL修饰，虽然在结构基础上与泛素化相似，但其生物学功能独具特色。它通过将UFM1共价结合到靶蛋白上，深刻影响着内质网（ER）应激、自噬、DNA损伤应答、细胞周期、免疫、脂代谢和发育等多种关键细胞过程。该过程的失调与发育缺陷、糖尿病和肿瘤等多种疾病密切相关。与泛素化类似，UFM1通过一个精密的三步酶促级联反应连接到底物上：UFM1前体被UFM1特异性半胱氨酸蛋白酶（UFSPs）切割C末端暴露出甘氨酸（Gly）残基而成熟；成熟的UFM1随后被类泛素修饰物激活酶5（UBA5，亦称UBE1DC1）通过ATP依赖性过程激活，形成UBA5-UFM1硫酯复合物；激活的UFM1被转移到UFM1结合酶1（UFC1或HSPC155）的Cys116上，最终通过UFM1特异性连接酶复合物（包含UFL1，亦称KIAA0776、NLBP、RCAD或Maxer）共价结合到靶蛋白上。值得注意的是，UFMylation系统仅依赖一个E1（UBA5）、一个E2（UFC1）和一个E3（UFL1），展现出高度的专一性。
2 UFMylation系统的核心组分
2.1 类泛素蛋白-UFM1
UFM1是一个9.1 kDa的蛋白质，在除酵母外的多种物种中进化保守。UFM1前体是一个85个氨基酸的多肽，采用经典的泛素β-折叠和α-螺旋结构。虽然序列同源性低于21%，但其成熟需要UFSPs切割末端丝氨酸和半胱氨酸残基，暴露甘氨酸，这与泛素的激活方式不同。UFM1在生理pH下带正电荷，确保其不被其他去泛素化酶识别。UFM1的6个赖氨酸残基（K3, K7, K19, K34, K41, K69）中，目前已知K69可介导多聚UFMylation。
2.2 E1-UBA5
UBA5是UFMylation系统的E1激活酶，属于非经典E1酶家族，分子量较小（44.7 kDa）。与经典E1不同，UBA5缺乏第一个和第二个催化半胱氨酸结构域以及泛素折叠结构域（UFD）。它由腺苷化结构域（AD，内嵌催化半胱氨酸C250）、UFM1相互作用序列（UIS）和UFC1结合序列（UBS）组成。在溶液中，UBA5通过其AD结构域形成同源二聚体，这种二聚体形式是UFM1激活和转移所必需的。UFM1结合可稳定二聚体并变构激活另一个亚基。二聚体中，一个亚基作为“受体亚基”通过UIS结合UFM1，另一个亚基作为“供体亚基”，通过AD结构域催化UFM1腺苷化，并通过UBS招募E2酶UFC1，实现分子间激活。
2.3 E2-UFC1
UFC1是一个19.4 kDa的蛋白质，分布于细胞核和细胞质。它通过其α-螺旋1和β-链1与一个UBA5相互作用，并通过其Cys116从另一个UBA5接收UFM1。UBA5中连接UIS和UBS的连接子（347-377）对于改变蛋白质的物理化学特性、促进UFM1与UFC1的Cys116靠近至关重要。UFC1独特的表面疏水口袋与UBA5中的连接子共同确保UBA5与UFC1的特异性结合。
2.4 E3-UFL1复合体
UFL1、UFBP1和CDK5RAP3共同构成UFMylation的E3连接酶复合体。UFL1是核心组分，主要位于内质网膜，也分布于细胞质和细胞核。UFL1缺乏HECT、RING或U-box等常见的E3连接酶结构域，而是包含一个部分翼状螺旋（pWH）结构域、五个翼状螺旋（WH）结构域和一个功能未定的C末端区域。UFBP1的N端包含跨膜结构域（将其锚定在内质网上）、α-螺旋结构域、内在无序区域（IDR）、WH结构域和部分WH结构域。UFBP1的WH结构域与UFL1的五个WH结构域互补，激活E3连接酶活性。UFBP1的K267位点的UFMylation修饰通过变构调节增强E3连接酶复合体的稳定性。CDK5RAP3作为该复合体的调节辅因子，其结构与哑铃相似。在没有底物时，CDK5RAP3结合UFL1/UFBP1复合体，通过阻断其与UFC1的相互作用抑制E3连接酶活性，确保修饰的精确性。当底物（如60S核糖体亚基）存在时，CDK5RAP3的抑制被解除，允许UFMylation发生。与经典的RING/HECT结构不同，UFL1-UFBP1复合体通过WH结构域的排列和复合体组装形成独特的催化界面，实现E2-底物的空间靠近。
2.5 UFSP1和UFSP2
UFSPs介导UFM1的成熟以及UFM1从靶蛋白上的解离。UFSP1主要存在于细胞质，而UFSP2在其N端比UFSP1多250个氨基酸残基，定位于细胞核和内质网。UFSP2通过其N端结构域介导内质网上UFBP1和RPL26的去UFMylation。UFSP1可能通过去除UFC1上Lys122的UFM1来抑制UFC1的活性。
3 与UFMylation相关的细胞过程
UFMylation在维持细胞稳态中扮演着不可或缺的角色，其已知底物功能多样。
3.1 核糖体质量控制（RQC）
UFM1对核糖体蛋白L26（RPL26）的K132和K134残基的修饰研究最为深入。核糖体的UFMylation受蛋白质在内质网共翻译转运停滞的调节，同时它影响内质网与SEC61转运子的相互作用，促进核糖体亚基的回收，从而促进内质网蛋白质的生物合成并抑制蛋白质的溶酶体或蛋白酶体降解。UFMylation在内质网-RQC中起着重要作用。
3.2 内质网应激
UFMylation通过影响内质网相关降解（ERAD）和内质网自噬（ER-phagy）在调节内质网稳态中发挥关键作用。UFL1和UFBP1在内质网上的定位提示了UFMylation参与内质网稳态。除了上述对RPL26的修饰外，UFMylation还参与IRE1α/XBP1和PERK信号通路。UFMylation失调会激活凋亡通路和内质网应激。内质网AD途径中的E3泛素连接酶HRD1的Lys610可被UFM1修饰，此修饰增强HRD1的E3连接酶活性，加速错误折叠蛋白的降解，表明UFMylation可与泛素化交叉对话，协同维持内质网稳态。
3.3 内质网自噬（ER-Phagy）
当未折叠蛋白反应（UPR）无法解决蛋白质错误折叠时，UFMylation参与内质网自噬以维持内质网稳态。停滞的核糖体激活UFMylation并诱导内质网或过客蛋白的自噬降解。UFMylation的失调还会影响自噬受体p62的周转。
3.4 DNA损伤应答（DDR）
UFMylation参与DNA损伤修复，促进PTIP-MLL3/4复合物的组装以加速停滞复制叉的降解，并增强对PARP抑制剂的敏感性。在双链断裂（DSBs）期间，MRE11的K282发生UFMylation，有助于MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物的组装并激活ATM（共济失调毛细血管扩张突变基因）。此修饰增强连接酶活性，促进ATM介导的DNA修复，并通过拮抗泛素化来稳定p53。UFMylation、ATM和p53之间的相互作用形成了一个对维持基因组完整性至关重要的调节轴。
3.5 炎症
UFMylation抑制γ-干扰素（IFN-γ）激活的巨噬细胞的促炎活性，并参与细胞内病原体的清除。UFMylation组分的破坏可通过调节内质网应激导致IFN-γ对诺如病毒复制的更强抑制。EB病毒编码的BILF1诱导线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）在K461发生UFMylation，促进其从线粒体膜上脱离及随后的溶酶体降解，从而抑制NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡。此外，UFL1通过促进14-3-3ε与UFM1的相互作用增强RIG-I介导的IFN释放，并稳定STING，防止其被TRIM29泛素化降解。
除了这些功能，UFMylation对于发育、细胞分化和细胞周期调控也至关重要。UFMylation还促进细胞周期进程和p53稳定性，这对肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性具有重要意义。
4 靶向UFMylation治疗癌症
UFMylation系统组分在肿瘤发生中的表达异常或失调已被广泛报道，使其成为有潜力的癌症治疗靶点。
4.1 UFM1在癌症中的作用
UFM1在胃癌和肝癌组织中表达下调。在胃癌中，UFM1通过促进PDK1泛素化和蛋白酶体降解，抑制PI3K/AKT信号通路和上皮-间质转化（EMT），从而阻碍胃癌进展。因此，肿瘤中UFM1升高提示了靶向MAPK/ERK通路治疗癌症的潜力。索拉非尼等酪氨酸激酶抑制剂可通过对抗UFM1过表达来抑制UFMylation。靶向UFM1底物可能为某些肿瘤类型提供治疗途径。例如，ERα和ASC1的UFMylation通过增强ERα的稳定性和转录活性促进乳腺癌进展。二甲双胍通过抑制UFM1表达和稳定SLC7A11诱导乳腺癌铁死亡。UFMylation在免疫调节中也发挥复杂作用，例如UFMylation修饰PD-1会抑制CD8+T细胞活性，而UFMylation与泛素化协同则可促进PD-L1降解。
4.2 UBA5在癌症中的作用
研究表明UBA5在乳腺癌细胞中上调，抑制UBA5可抑制乳腺癌细胞生长。同样，UBA5被报道可促进胰腺癌进展。目前已发现多种UBA5抑制剂，如Usenamine A、腺苷-5'-磺酸（ADS）、锌腺苷酸（II）环蛋白衍生物复合物8.5和共价抑制剂DKM2-93，它们在临床前研究中显示出抗癌潜力。
4.3 UFL1复合体在癌症中的作用
UFL1在肺癌早期高表达，可能通过结合p120连环蛋白并抑制其泛素化来促进肿瘤生长。在肝细胞癌（HCC）中，UFL1表现出抑制细胞侵袭的作用，其机制包括抑制NF-κB通路和稳定CDK5RAP3。UFBP1与胃癌患者不良预后相关，其下调通过NRF2/AKR1C信号轴与顺铂耐药有关。CDK5RAP3在癌症中的作用具有情境依赖性，它可能抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路，在胃癌中扮演肿瘤抑制角色，但在肺癌等某些癌症中又可能高表达，充当癌基因。
4.4 UFSPs在癌症中的作用
UFSP2在结肠癌中被认为是一个潜在的肿瘤抑制因子。然而，也有研究报道UFSP2通过去除PD-L1的UFM1修饰来增强PD-L1的稳定性，从而发挥促癌作用。这种相反的作用凸显了UFSP2功能的复杂性。
4.5 UFMylation在癌症中的双重作用
UFMylation在癌症中的双重调节作用可归纳为：底物偏好决定功能结局；UFMylation与泛素化之间存在协同或拮抗的交叉对话；组织及免疫微环境影响UFMylation的功能。这种双重性使得靶向UFMylation治疗癌症需要精准的策略。
4.6 临床相关性
目前针对UFMylation的靶向治疗经验有限。开发变构抑制剂、抗体药物偶联物（ADCs）以及联合治疗（如AMPK激活剂联合CTLA-4抗体）是潜在的方向。开发监测体内UFMylation动态变化的技术对于药物疗效评估至关重要。
5 结论与展望
5.1 单或多UFMylation
目前对UFMylation类型的研究相对有限。像P4HB、CYB5R3、组蛋白H4、RPS20/US10、EIF6和RPN1等蛋白质被UFM1修饰， specifically through mono-UFMylation。UFM1含有6个可能参与链组装的赖氨酸残基，但目前仅K69被证实是建立多聚UFMylation所必需的。多聚UFMylation已在ASC1、ERα、PD-1、RPL10和RPL26等底物上观察到。未来需要深入分析单和多UFMylation的调控机制及功能差异。
5.2 新型UFMylation底物的探索
鉴定UFM1的底物是阐明UFMylation功能的基础。UFM1占据的赖氨酸可能是其他UBLs的靶点，从而阻止该位点被其他UBL修饰。因此，未来研究的重点不仅是探索新底物，还要检测UFMylation如何影响其他UBL修饰。
5.3 酶的结构特征
UBA5以同源二聚体形式发挥作用。UBA5的N末端，特别是AA37-56，增加了UBA5与ATP的亲和力。UFC1与经典E2s的不同在于它缺乏催化性的HPN基序。UFL1是迄今为止UFMylation系统中唯一的E3连接酶。UFBP1和CDK5RAP3对于维持UFL1的功能和稳定性至关重要。阐明UFL1作为E3连接酶识别底物的结构基础是未来的挑战。
5.4 平衡ER-RQC和ER自噬
研究表明，ER-RQC超载会促进TAQC和/或ER自噬，但其潜在机制大多未知。E3复合体中的CDK5RAP3可能特异性负责RPL26的UFMylation并促进ER-RQC转换，因此CDK5RAP3被认为是内质网应激的传感器。
5.6 结论
UFMylation在癌症的发生发展中起着重要作用，表明该系统的组分是癌症潜在的治疗靶点。针对UFMylation的化学物为癌症提供了新的有希望的治疗策略。然而，候选化学物的缺乏和特异性阻碍了UFMylation靶向治疗的应用。需要进一步的研究来阐明UFMylation在不同癌症背景下的精确作用机制，并开发出有效且特异的靶向疗法。
