《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Protective Effect and Mechanism of Rosiglitazone in α-amanitin-induced Hepatotoxicity Via Activation of PPAR-γ/Nrf2 Signaling Pathway
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本文揭示了罗格列酮（RSG）通过上调PPAR-γ/Nrf2信号通路，有效缓解α-鹅膏蕈碱（α-AMA）诱导的小鼠急性肝损伤。研究表明，RSG干预能显著改善氧化应激（降低MDA、ROS，提升SOD、CAT）、减轻炎症反应（降低TNF-α、IL-6、IL-8）并抑制细胞凋亡（下调P53、Caspase-3），为鹅膏菌中毒的临床治疗提供了新的潜在策略。
1 引言
急性野生蘑菇中毒是中国食源性疾病的主要原因，其中含鹅膏毒素的蘑菇中毒是导致死亡的首要因素，约占蘑菇中毒致死病例的90%。α-鹅膏蕈碱（α-AMA）是鹅膏菌中的主要致死毒素，其半数致死剂量（LD50）极低，为0.05–0.1 mg/kg。α-AMA通过OATP1B3转运体进入肝细胞，主要通过抑制RNA聚合酶II（RNAPII）发挥毒性作用，但其确切中毒机制尚不完全清楚，且目前缺乏特异性解毒剂，导致死亡率极高。近年研究表明，氧化应激、炎症反应和细胞凋亡在α-AMA诱导的肝损伤中起关键作用。罗格列酮（RSG）是一种噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，可作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）的选择性激动剂。PPAR-γ是核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路的上游调节因子，具有强大的抗氧化和自由基清除作用。本研究旨在探讨RSG在α-AMA诱导的ICR小鼠急性肝损伤中的保护作用及机制，重点关注其对氧化应激、炎症信号和凋亡途径的调节。
2 材料与方法
2.1 试剂与抗体
α-AMA、RSG、试剂级玉米油和10%二甲基亚砜（DMSO）溶液购自MedChemExpress。小鼠丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。小鼠超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒购自Sigma-Aldrich公司。小鼠TNF-α、IL-6和IL-8的ELISA试剂盒以及抗Nrf2、抗PPAR-γ、抗HO-1和抗GAPDH抗体均购自Abcam公司。
2.2 实验动物
健康6-8周龄SPF级雄性ICR小鼠，体重约30-36克。小鼠在23±2°C、12小时光暗循环的受控条件下饲养，自由获取食物和水。为确定诱导肝损伤的α-AMA毒性剂量，以0、0.18、0.35或0.53 mg/kg的剂量向小鼠腹腔注射α-AMA，监测注射后5天的存活率。为评估RSG的治疗效果，将小鼠随机分为四组（每组n=10）：(1) 生理盐水+溶剂对照；(2) 生理盐水+RSG对照；(3) α-AMA中毒+溶剂对照；(4) α-AMA中毒+RSG治疗。RSG以20 mg/kg的剂量口服（溶于玉米油），在α-AMA注射前每天一次，连续给药3天。在α-AMA给药后24小时处死小鼠，收集血液和肾脏样本用于后续分析。
2.3 肝脏重量指数计算
肝脏重量指数计算公式为：肝脏重量指数 = (肝脏湿重[g] / 小鼠体重[g]) × 100%。
2.4 肝损伤评估
使用市售试剂盒测定血清ALT和AST水平。肝组织样本用10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片后进行苏木精-伊红（H&E）染色，光镜下观察组织病理学变化。
2.5 TUNEL染色
使用原位凋亡检测试剂盒对石蜡包埋的肝切片进行TUNEL染色，评估肝核DNA链断裂。凋亡细胞核发出绿色荧光，通过CCD成像系统进行荧光成像和分析。
2.6 肝组织抗氧化活性（SOD、CAT）、氧化应激（MDA）和炎性细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-8）分析
使用ELISA试剂盒测定肝组织中SOD、CAT、MDA、IL-6、IL-8和TNF-α的水平。
2.7 肝组织ROS检测
制备冰冻肝切片，室温解冻30分钟，固定后用0.3% Triton-X 100透化细胞膜30分钟。PBS洗涤后，用含0.3% Triton-X 100的5%山羊血清封闭30分钟。随后在37°C恒温箱中孵育2小时。加入MitoSOXTM工作液，37°C避光孵育30分钟。PBS洗涤后，加入DAPI染色，荧光显微镜下观察并捕获ROS表达。
2.8 Nrf2信号通路和凋亡相关蛋白表达检测
收集小鼠肝组织，用RIPA裂解缓冲液裂解。采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白通过10% SDS-PAGE分离，转至PVDF膜。膜在室温下用脱脂牛奶封闭30分钟，随后在4°C下与稀释的一抗孵育过夜，然后在室温下与相应的二抗孵育2小时。使用Bio-Rad成像系统检测蛋白条带。
2.9 统计方法
所有实验数据使用GraphPad Prism（8.0版）进行分析，以均值±标准差（SD）表示。两组均值比较采用T检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P < 0.05认为有统计学意义。
3 结果
3.1 α-AMA诱导毒性模型中剂量和采样时间的优化
为确定α-AMA诱导小鼠肝损伤的最佳剂量和采样时间，观察了不同剂量的死亡率变化。选择死亡率最低的剂量组（0.35 mg/kg，第5天存活率为40%）用于后续实验。在该剂量下，72小时肝组织H&E染色显示显著的病理变化，包括肝索结构紊乱、广泛的肝细胞变性和水肿以及肝小叶内大量炎性细胞浸润，表明肝损伤最严重。血清肝损伤标志物ALT和AST水平逐渐升高，呈现时间依赖性趋势（P < 0.05）。
3.2 RSG对肝损伤的保护作用
与空白对照组相比，RSG对照组的肝脏重量指数无显著变化。在α-AMA诱导的中毒组中，肝脏重量指数显著增加。然而，在RSG干预组中，同一时间点的肝脏重量指数显著低于α-AMA中毒组（P < 0.05）。α-AMA中毒组血清ALT和AST水平显著升高。RSG干预后，ALT和AST水平高于空白对照组，但显著低于α-AMA组（P < 0.05）。H&E染色显示，α-AMA组肝组织出现显著病理变化，而RSG治疗减轻了α-AMA中毒小鼠的肝损伤程度。这些发现表明RSG治疗改善了α-AMA诱导的小鼠肝细胞损伤。
3.3 RSG治疗降低α-AMA中毒小鼠肝组织凋亡水平
TUNEL技术结果显示，α-AMA中毒小鼠肝脏中TUNEL标记的凋亡细胞（绿色）数量显著增加。RSG治疗后，凋亡细胞数量较α-AMA中毒组减少，表明α-AMA中毒导致小鼠肝细胞过度凋亡，而RSG干预减轻了肝脏病理损伤（P < 0.05）。
3.4 RSG治疗降低α-AMA中毒小鼠肝组织ROS水平
免疫荧光测定显示，α-AMA中毒小鼠肝组织中ROS（红色）表达水平显著升高。RSG治疗后，ROS表达水平较中毒组降低，表明RSG治疗减轻了α-AMA中毒引起的氧化应激损伤（P < 0.05）。
3.5 RSG治疗改善抗氧化应激反应并减轻α-AMA中毒小鼠肝脏氧化应激
ELISA结果显示，与对照组相比，α-AMA中毒小鼠肝脏中SOD和CAT活性显著降低，而MDA水平显著升高。RSG治疗后，SOD和CAT活性显著升高，MDA水平显著降低（P < 0.05），表明RSG治疗减轻了α-AMA中毒引起的肝细胞氧化应激。
3.6 RSG治疗减轻α-AMA中毒小鼠肝脏炎症反应
ELISA结果显示，α-AMA中毒后肝脏中促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8水平显著升高。RSG治疗后，TNF-α、IL-6和IL-8水平较α-AMA中毒组显著降低（P < 0.05），表明RSG治疗减轻了α-AMA中毒引起的炎症反应。
3.7 RSG治疗上调Nrf2信号通路相关蛋白表达，减轻α-AMA中毒小鼠肝脏氧化应激和凋亡
Western blot结果显示，在α-AMA中毒小鼠中，PPAR-γ、Nrf2和HO-1的表达显著下调，而P53和Caspase-3的表达显著增加。然而，RSG治疗显著上调了α-AMA中毒小鼠肝脏中PPAR-γ、Nrf2和HO-1的表达（P < 0.05），并下调了P53和Caspase-3的表达（P < 0.05）。这些发现表明，RSG通过激活PPAR-γ并促进Nrf2信号通路，减少肝细胞氧化应激和过度凋亡，从而减轻α-AMA中毒小鼠的肝损伤。
4 讨论
本研究证实α-AMA中毒可诱导小鼠急性肝损伤，其机制与破坏氧化还原稳态，导致氧化应激、炎症反应和过度凋亡有关。RSG通过激活PPAR-γ/Nrf2信号通路减轻氧化应激，从而减少炎症和凋亡，最终缓解α-AMA诱导的急性肝损伤。研究结果表明RSG具有治疗α-AMA所致肝损伤的潜力。氧化应激是α-AMA引起严重肝毒性的核心机制。α-AMA作为具有自由基特性的反应中间体，进入细胞后产生过量ROS，从而破坏氧化还原平衡。这种失衡引发氧化应激，激活炎症信号级联并启动凋亡通路，最终导致肝细胞死亡。Nrf2信号通路是最关键的内源性抗氧化防御机制，调节体内的各种氧化还原平衡和抗氧化蛋白的表达。PPAR-γ通过结合Nrf2基因启动子区的过氧化物酶体增殖物激活反应元件（PPRE）启动Nrf2基因转录，诱导多种下游抗氧化基因的表达，从而发挥抗氧化作用。RSG作为PPAR-γ的特异性激动剂，可激活其表达，进而增强Nrf2信号通路。这种激活增加了下游抗氧化酶基因的表达，有助于调节ROS水平并维持氧化还原稳态。通过减轻氧化应激，RSG可减少炎症反应和凋亡。总之，抑制ROS产生并改善炎症和凋亡过程可能为治疗α-AMA中毒提供有效策略。在此背景下，RSG作为一种能够上调PPAR-γ、激活Nrf2信号通路从而改善氧化应激、炎症反应和凋亡的治疗方法显示出前景。
