利用ChIP-质谱技术识别端粒处与POT1相关复合物的蛋白质组学方法

《Methods》：Proteomics method for identifying POT1-associated complexes at telomeres using ChIP-Mass spectrometry

本研究通过CRISPR-Cas9技术构建内源Flag标记的POT1细胞模型，利用ChIP-MS解析其与端粒的蛋白互作网络，发现多种与端粒保护、DNA修复及细胞周期调控相关的关键蛋白，为端粒生物学研究及癌症治疗提供新视角。

　　

Nikita Harish Zade|Meghna Jain|Manoj Garg|Rahul Checker|Arkasubhra Ghosh|Ekta Khattar

印度孟买SVKM的NMIMS大学（被认定为）Sunandan Divatia科学学院

摘要

POT1是shelterin复合体中唯一的单链端粒结合蛋白。它与TPP1一起，在调节端粒长度和保护端粒免受DNA损伤修复蛋白的损害方面起着关键作用。端粒处DNA损伤修复蛋白的激活可能对细胞有害，因此必须抑制它们的活性。POT1通过与TPP1的结合与其他端粒蛋白（TRF2、TRF1、TIN2和RAP1）相互作用。这些蛋白质共同作用以保护和维持端粒。尽管对POT1在shelterin复合体中的作用有深入了解，但其在单链端粒突出部分的所有相互作用者仍不甚明确。为了研究这些相互作用，我们使用CRISPR-Cas9基因编辑系统生成了带有Flag标签的POT1敲入突变体。为避免这种技术可能导致的基因干扰风险，我们对带有Flag标签的POT1克隆进行了深入表征，以确保其端粒和TPP1结合功能保持完整。此外，我们使用ChIP-MS对染色质中的Flag标签POT1进行了蛋白质组分析。我们的分析揭示了一组新的与POT1相关的蛋白质，它们位于端粒的末端。鉴于POT1仅与端粒的单链3′突出部分结合，所得蛋白质组数据表明POT1的相互作用发生在端粒的极端位置。总之，我们的研究利用ChIP质谱方法发现了以前未表征的与POT1相关的蛋白质，为进一步研究端粒生物学和针对端粒调节的潜在疗法奠定了基础。

引言

端粒是位于染色体末端的重复六核苷酸序列（TTAGGG）n。端粒对于维持基因组稳定性至关重要，并在决定细胞寿命方面起着重要作用[1]、[2]、[3]、[4]。POT1蛋白是shelterin复合体的关键组成部分，它结合端粒的3′单链富G突出部分和双链-单链连接处，防止DNA损伤反应的激活[5]、[6]、[7]、[8]。POT1包含三个寡核苷酸/寡糖结合（OB）结构域：OB1和OB2与单链端粒DNA结合，稳定其与端粒的关联，而OB3含有Holliday连接酶结构域，有助于其与TPP1的相互作用，从而调节端粒酶的招募[7]。此外，POT1通过招募CST复合体参与5′端切除过程，保护端粒不被识别为双链DNA损伤[9]。OB1和OB2的突变会损害DNA结合能力，导致端粒酶活性异常、端粒过度延长和基因组不稳定[10]。功能异常的POT1与多种癌症有关，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和结直肠癌[11]。

端粒蛋白质组分析揭示了多种新蛋白质在端粒长度调节和端粒保护中的作用[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。Déjardin和Kingston开发了PICh（分离染色质片段的蛋白质组学）方法，利用LNA探针在不标记蛋白质的情况下分离端粒染色质，并鉴定了已知的和ALT特异性的端粒蛋白[13]。在后续研究中，Nittis等人使用HA-Flag标签的TIN2和改良的染色质免疫沉淀（IP）方法结合抗Flag抗体，随后进行交联和质谱分析，鉴定了所有shelterin成分以及62种新的端粒结合蛋白[17]。Fujita等人开发了enChIP-MS协议，使用3×Flag标签的TAL蛋白靶向端粒重复序列，鉴定了已知和新的端粒结合蛋白[12]。Grolimund等人引入了QTIP方法，通过染色质交联、TRF1和TRF2端粒蛋白的免疫纯化以及SILAC-MS实现了基于探针的端粒富集，从而鉴定了shelterin蛋白和端粒状态依赖性因子如SMCHD1和LRIF1[14]。Garcia-Exposito等人使用BioID和BirA标签的TRF1及链霉亲和纯化技术，发现Polη是ALT端粒复制应激的关键调节因子[18]。Pinzaru等人结合CRISPR干扰和BioID链霉亲和纯化技术，证明突变型POT1会诱导复制应激、端粒脆弱性以及向核孔的重新定位[19]。重要的是，这项工作还系统地鉴定了野生型和突变型背景下的POT1蛋白相互作用网络。Lin等人改进了之前的QTIP方法，结合EdU标记和点击化学及链霉亲和纯化技术，从新生DNA上分离蛋白质（QTIP-iPOND）[15]。尽管使用PICh、enChIP-MS、QTIP、BioID和基于CRISPR的方法在端粒蛋白质组学方面取得了显著进展，但这些研究尚未全面表征内源性POT1相关的天然蛋白质组。此类研究对于阐明端粒末端的蛋白质景观、深入了解其保护和调节机制至关重要。

研究方法

为了研究端粒末端蛋白质组，我们改造了POT1基因，在其5′翻译起始位点插入了Flag标签编码序列。这种方法保留了生理表达水平，同时便于功能分析[20]。重组细胞系经过严格验证，确保插入的标签不会影响POT1的功能或改变细胞系特性。随后，我们使用Flag亲和纯化技术分离与POT1相关的蛋白质复合物，以捕获端粒末端的天然蛋白质组。我们的研究为研究端粒末端新发现的蛋白质的潜在功能提供了一个可靠且生理相关的平台。

部分内容

修复模板设计与转染

卵巢癌细胞系A2780野生型细胞在含有10% FBS（GIBCO #Cat No. 1132003316140071）和1% 抗生素及抗真菌剂（SIGMA #Cat No. A5955）的DMEM细胞培养基（GIBCO #Cat No. 11965126）中培养，培养条件为37?C和5% CO?。Cas9载体px458及其携带的POT1特异性gRNA构建体（pSp-Cas9-GFP-POT1 gRNA）由Dr. Lingner Joachim提供。质粒通过标准程序转化Escherichia Coli DH5 Alpha感受态细胞进行扩增

使用CRISPR-Cas9在POT1基因中生成Flag标签敲入突变体

据报道，POT1特异性地与端粒末端结合，迄今为止只有一项研究报道了过表达POT1的蛋白质组[19]。主要限制在于用于免疫沉淀检测的POT1抗体效果较弱。使用过量抗体可能会干扰质谱数据的获取。为解决这一问题，我们开发了一种细胞系模型，在POT1基因的N末端插入了Flag标签编码序列

DNA结合蛋白

我们研究中显著富集的DNA结合蛋白包括H2BC18、ANP32E、TOP2B、MCM6、GTF2I和MED23，这些蛋白在端粒生物学中发挥着重要作用。H2BC18是一种核心组蛋白变体，暗示可能存在端粒的染色质重塑或结构变化[40]。ANP32E作为组蛋白伴侣和染色质重塑因子，能够特异性去除组蛋白变体H2A.Z[41]。H2A.Z在双链断裂处积累，随后被迅速清除

RNA结合蛋白

在POT1中富集的RNA结合蛋白包括HNRNPUL2、GIGYF2、FUBP1、PRPF19、WDR36、SRP9、RALY、POLR2H、HDGF和EIF3I。HNRNPUL2属于异质核核糖核蛋白（hnRNP）家族的RNA结合蛋白。先前的研究表明，多种hnRNP家族成员与含有端粒重复序列的TERRA相互作用[52]。除了在RNA生物学中的作用外，HNRNPUL2还参与DNA损伤反应

染色质修饰酶

HDAC1和HDAC2在POT1 ChIP–MS数据集中被鉴定为富集的染色质修饰酶，是调控染色质结构、DNA修复和端粒相关过程的已知因子。研究表明，亚端粒特异性浓缩的染色质受多种组蛋白修饰的调控[71]。HDAC1和HDAC2通过促进DNA非同源末端连接（NHEJ）参与DNA损伤反应[72]。在缺乏适当POT1–TPP1保护的端粒中，复制体会受到影响

激酶

STK38和CDK2的检测表明激酶信号通路在端粒中起着重要作用，特别是在协调细胞周期进展、DNA修复和端粒保护机制方面。值得注意的是，STK38（也称为NDR1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与Hippo通路相关，并在激活ATM介导的DNA损伤修复中起关键作用[76]。CDK2因参与细胞周期调控而闻名[77]。

G蛋白

小GTP酶KRAS和RAB1B以及G蛋白ARF3的富集表明，在应激条件下通过POT1的相互作用存在协调的GTP酶信号通路。KRAS在BioGRID数据库中被鉴定为POT1的相互作用蛋白，而ARF3在端粒酶阳性细胞系中被观察到。RAB1B在PICh实验中的端粒酶和ALT阳性细胞中被发现。因此，这些蛋白在我们的研究中位列显著富集的前五名

泛素

CACYBP参与蛋白质的泛素化和降解，以及细胞周期控制和细胞骨架组织[78]。其在Déjardin研究中的端粒酶阳性细胞系中的鉴定支持其在端粒中的潜在作用。在复制应激或DNA损伤条件下，CACYBP可能有助于调节shelterin成分（如POT1）的稳定性和周转

其他酶

在其他研究中，LEG1、PRDX2、ACLY、MDH2和PAICS等酶也在POT1和端粒中被发现。虽然这些酶通常位于细胞质中，但它们的存在和调控可能表明它们在细胞应激反应机制中起着重要作用，间接影响端粒的维持和稳定性。相关研究表明，PRDX1定位于端粒并保护端粒DNA免受氧化损伤[79]、[80]、[81]

结论

先前的研究使用共免疫沉淀（Co-IP）技术对端粒蛋白质组进行了广泛研究[15]、[82]、[83]。通过比较蛋白质组分析，发现POT1敲除细胞中的蛋白质表达谱发生显著变化，反映了端粒维持过程和下游信号通路的紊乱。在表达外源性POT1后，对这些蛋白质组变化进行了评估

关于生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明

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未引用的参考文献

[91]、[92]

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

该项目由塞尔维亚科学和技术部（SERB）资助，资助对象为Ekta Khattar博士（ECR/2018/002117）。Nikita Harish Zade获得了Lady Tata Memorial Trust的奖学金支持。主要实验由NZ在Sunandan Divatia科学学院（NMIMS大学）完成。手稿的准备和编辑工作由NZ和EK共同完成。Cas9-GFP-POT1 sgRNA质粒由Dr. Joachim Lingner（瑞士洛桑EPFL）慷慨提供。质谱分析设施由