《Microchemical Journal》：Development of a dually-amplified analytical method for rapid, specific and ultrasensitive detection of avian influenza virus H5N1 DNA
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本研究开发了一种基于Exo III介导的高灵敏度双信号放大平台（HSDSA）用于H5N1基因序列检测。该平台通过靶DNA与发夹DNA（Hp DNA）的杂交及Exo III的循环水解实现两次信号放大，线性范围0.08-15 nM，检测限54 pM，在人血清样本中验证回收率98.75%-105.83%，显著提升低丰度核酸检测灵敏度。
梁工|林珠|徐文成|单秀芝|谭美朵|顾玉斌|周娟|刘思华
湖南工业大学生命科学与化学学院，中国株洲412007
摘要
流感病毒感染，尤其是由禽流感病毒引起的感染，每年导致数百万人死亡并造成巨大的经济损失。在疫情初期对病原体进行早期诊断对于有效控制疫情至关重要。本研究开发了一种基于Exo III介导的高灵敏度双信号放大（HSDSA）平台，用于检测H5N1基因序列。该检测机制通过目标H5N1 DNA与发夹DNA（Hp DNA）的杂交形成双链结构来启动。在这种结构中，Hp DNA可以被Exo III识别并部分水解，释放出目标DNA和游离DNA。一方面，目标DNA能够与其他Hp DNA杂交并自由循环，实现第一轮放大；另一方面，游离DNA可以与标记在金纳米粒子（AuNPs）上的DNA结构杂交，将原本的三端突出双链结构转变为三端凹陷的Exo III底物结构。触发Exo III识别后，dsDNA内的长链（SH DNA）被水解，再次释放出游离DNA，进入第二轮放大循环。同时，从水解的SH DNA中释放出的另一种标记有羧基荧光素（FAM DNA）的DNA使荧光团从AuNPs上脱落，从而恢复荧光信号。这种策略通过Exo III介导的双循环信号放大显著提高了检测灵敏度，H5N1 DNA的线性检测范围为0.08?nM至15?nM，检测限为54 pM。该荧光传感器在检测人血清样本中的H5N1时表现出强大的适用性，回收率在98.75%至105.83%之间。这些结果凸显了HSDSA平台在低丰度分子检测、疾病诊断和生物医学应用方面的潜力。
引言
近年来，SARS、MERS、H1N1流感、COVID-19等病毒的爆发给全球经济带来了不可估量的损失，同时也对人们的健康造成了严重危害[1]，[2]。开发精确高效的病毒检测方法对于临床诊断、疫情控制和公共卫生决策至关重要[3]，[4]。已经建立了多种检测技术，包括荧光探针[5]、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）[6]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[7]、表面等离子共振（SPR）[8]和微流控芯片技术[9]。其中，荧光探针技术因其高灵敏度、特异性和实时监测能力而脱颖而出[10]。然而，在低丰度病毒检测方面，尤其是在感染早期或环境样本中，挑战在于需要将荧光探针与信号放大技术相结合。这种组合对于提高检测灵敏度和准确性至关重要。
生物传感中常用的信号放大方法大致可以分为酶介导和非酶介导的信号放大[11]。酶介导的方法，如链置换放大（SDA）[12]、环介导等温放大（LAMP）[13]、滚环放大（RCA）[14]和基于核酸序列的放大（NASBA）[15]，[16]，因其高效的信号增强能力而受到青睐。这些技术利用酶活性促进目标和信号的循环利用，实现目标与信号的一对多放大[17]。这些方法的关键在于设计合适的DNA探针，使其在与目标结合后能够被消化并释放，从而启动信号放大循环[18]。这样的信号放大平台可以克服传统传感方法的局限性，如非特异性吸附和假阳性问题，同时在不改变目标浓度的情况下增强输出信号强度[19]。例如，廖等人成功构建了一种高灵敏度的无标记荧光传感器，利用三循环信号放大技术，实现了0.32 pM的检测限[20]；王等人设计了一种新型电化学适配器传感器，具有双循环信号放大功能，检测限为4.0 pM[21]；此外，赛等人开发了一种低成本、高灵敏度的双信号放大比色生物传感器，检测限为9.7 fM[22]，其动态线性范围覆盖了四个数量级。
虽然这些方法能够特异性地检测目标物质，但通常需要复杂的DNA序列设计以实现高效的信号放大。此外，据报道这些生物传感器的灵敏度还有进一步提升的空间[23]。幸运的是，外切核酸酶（Exo）辅助的信号放大提供了一种解决方案，通过Exo介导的目标循环实现放大。外切核酸酶III（Exo III）作为一种序列独立的核酸酶，不需要探针及其目标具有特定的核苷酸序列[24]，[25]，因此对目标序列没有限制，大大扩展了其应用范围。例如，赵等人开发了一种多功能传感平台，包括一个易于制备的捕获模块和一个Exo III辅助的级联信号放大模块，用于识别癌胚抗原和小胞外囊泡（SEVs），检测限为0.075?ng/mL[26]；此外，徐等人基于Exo III辅助的催化发夹组装（EACHA）技术开发了一种用于农药检测的自动荧光配体传感器，检测限为0.93?ng/mL[27]。
H5N1作为一种禽流感病毒，具有高度致病性、致命性和变异性，对家禽产业和公共卫生构成重大威胁[28]，[29]，[30]，[31]。因此，迫切需要开发快速、准确和灵敏的禽流感检测技术。因此，我们选择H5N1作为疾病模型，并开发了一种由目标激活的双信号放大检测平台，能够实现相关DNA的高灵敏度和特异性检测。所提出的方法具有多个显著优势。特别是，双循环信号放大平台由于目标分子与酶之间的循环反应（即Exo III的酶消化特性与核酸分子之间的特异性杂交）显著提高了检测灵敏度。而且，同一酶（Exo III）驱动两个循环，减少了多种反应物带来的干扰。此外，整个放大过程无需标记物，不仅降低了成本，还减少了背景干扰。我们使用H5N1作为代表性的禽流感病毒来验证我们概念的有效性。同时，我们预计这一设计将有助于推动疾病诊断和临床医学的发展。
材料与试剂
所有DNA寡核苷酸链均购自上海桑贡生物科技有限公司（Sangon Biotech. Co., Ltd.），所有序列的详细信息列在表S1中。4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸钠盐（HEPES）、Tris-(羟甲基)氨基甲烷（Tris）、醋酸钠、醋酸镁、醋酸钾、氯金酸、三钠柠檬酸二水合物和Tris-(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）购自新华制药化学试剂有限公司。醋酸
H5N1 DNA检测的HSDSA平台设计
H5N1 DNA检测的双信号放大平台示意图如图1所示。标记有羧基荧光素（FAM DNA）的DNA与标记有巯基（SH DNA）的单链DNA杂交，后者修饰在AuNPs上形成具有3′端突出的双链结构；同时，发夹DNA（Hp DNA）也在3′端突出，两者都不能被3′外切核酸酶识别。由于FAM靠近AuNPs，因此可以发生荧光反应
结论
总之，我们成功开发了一种基于Exo III介导的双信号放大的高灵敏度和特异性生物传感平台，用于检测H5N1 DNA。该生物传感平台在0.08–15?nM的H5N1 DNA浓度范围内显示出F0与CDNA之间的良好线性关系，检测限为54 pM。此外，该生物传感平台对各种分析物具有高特异性，包括单碱基、双碱基和三碱基错配情况
CRediT作者贡献声明
梁工：撰写初稿、获取资金、概念构思。林珠：正式分析、数据管理。徐文成：方法学研究、实验操作。单秀芝：软件开发、方法学设计。谭美朵：资源调配。顾玉斌：验证工作。周娟：项目监督、行政管理。刘思华：撰写、审稿与编辑、监督。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：梁工报告获得了湖南省自然科学基金的财政支持；谭美朵获得了湖南省自然科学基金的财政支持；梁工还获得了湖南省教育厅科研基金的支持。
致谢
本研究得到了湖南省自然科学基金（2022JJ50062、2024JJ76654）和湖南省教育厅科研基金（22B0606）的支持。
