《Journal of Neurochemistry》：Prosaposin Is Cleaved Into Saposins by Multiple Cathepsins in a Progranulin-Regulated Fashion
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本综述系统阐述了鞘脂激活蛋白前体（PSAP）被多种组织蛋白酶（Cathepsins）切割为鞘脂激活蛋白（Saposins）的分子机制，并揭示了颗粒体蛋白前体（PGRN）及其多颗粒体蛋白片段（MGFs）对此过程的调控作用。研究通过体外酶切实验、CRISPRi神经元模型及溶酶体分离技术，证实了组织蛋白酶D（CTSD）、E（CTSE）、B（CTSB）等多种蛋白酶在特定pH条件下对PSAP的差异性切割能力，并发现PGRN衍生的MGF片段CDE能显著增强CTSD的切割活性。该发现为理解溶酶体功能、鞘脂代谢稳态及神经退行性疾病（如额颞叶痴呆、溶酶体贮积症）的病理机制提供了新视角，也为干预saposin水平提供了潜在靶点。
引言：溶酶体与神经退行性疾病的联系
神经退行性疾病的关键因素之一是蛋白质和脂质稳态的进行性恶化，导致不溶性大分子积累和细胞功能障碍。溶酶体作为降解和回收大分子的细胞器，对维持细胞稳态至关重要。溶酶体功能障碍与青少年发病的溶酶体贮积症和成人发病的神经退行性疾病相关。特别是，鞘脂代谢紊乱是神经退行性疾病发生和发展的风险因素。
鞘脂代谢由鞘脂酶驱动，而鞘脂激活蛋白（Saposins）是生物活性肽，可催化鞘脂酶活性。鞘脂激活蛋白前体（PSAP）是四种主要Saposins（SapA、SapB、SapC、SapD）的前体，对鞘脂分解代谢通路至关重要。维持最佳的PSAP和saposin水平对于正常的溶酶体功能和鞘脂稳态至关重要，PSAP功能障碍与青少年发病的溶酶体贮积症和年龄相关的神经退行性疾病有关。然而，saposin从PSAP释放的机制尚不明确。
PSAP与另一种溶酶体蛋白颗粒体蛋白前体（PGRN）直接相互作用并共同运输。PGRN功能丧失突变会导致额颞叶痴呆等神经退行性疾病。近期研究表明PGRN与疾病相关的鞘脂稳态功能障碍有关。在溶酶体中，PGRN被一组溶酶体蛋白酶依次切割成多颗粒体蛋白片段（MGFs）中间体和最终具有生物活性的颗粒蛋白，而PGRN和MGFs促进组织蛋白酶D（CTSD）的激活。由于CTSD已知能催化PSAP切割成saposins，这可能是PGRN间接影响脂质代谢的一种机制。
材料与方法
研究采用体外蛋白酶切割实验，将重组人PSAP与分离的人肝溶酶体（HLLs）或多种重组人组织蛋白酶在不同pH条件下孵育，通过蛋白质印迹和银染分析切割产物。使用CRISPR干扰技术在人iPSC来源的神经元中敲低CTSL、天冬酰胺特异性内肽酶（AEP）和CTSD的表达，验证其在PSAP加工中的作用。通过溶酶体免疫沉淀技术从SH-SY5Y细胞中分离神经元溶酶体，研究PGRN及其MGF片段对PSAP切割的调节。CTSD活性通过荧光法CTSD活性测定试剂盒进行检测。
结果1：多种溶酶体蛋白酶在体外切割全长PSAP
将重组PSAP与分离的人肝溶酶体在体外共孵育，发现HLLs能将PSAP切割成分子量约为二聚saposin和三聚saposin的片段。使用天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A抑制CTSD活性后，HLLs切割PSAP的能力未受显著影响，提示HLLs中存在其他能处理PSAP的蛋白酶。
随后，研究测试了多种重组人溶酶体组织蛋白酶在四种pH条件下切割PSAP的能力。天冬氨酸蛋白酶CTSD和CTSE均能处理PSAP，但CTSE在pH 3.5和4.5条件下几乎能将PSAP完全还原为saposins，效率高于CTSD。丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶中，CTSG、CTSB、CTSK、CTSL、CTSS、CTSV和AEP能产生saposin，而CTSF、CTSC和CTSX能降解全长PSAP但未产生明显的saposin片段。这些蛋白酶的切割活性具有pH依赖性，多数在酸性pH下活性最佳，但CTSG、CTSB、CTSK和CTSS在pH 7.4下也能切割PSAP。不同蛋白酶的切割动力学差异显著，部分蛋白酶能快速完全降解PSAP，而其他则产生不同大小的中间片段。
结果2：组织蛋白酶以不同速率产生Saposins和多Saposin片段
根据切割效率，将能产生saposin的蛋白酶分为“高效”和“低效”两组进行时间进程实验。“高效”蛋白酶（CTSE、CTSG、CTSB、CTSK、CTSS）在30分钟内能产生全部四种saposin，其中CTSG效率最高，5分钟内即可将PSAP完全消化为saposin。“低效”蛋白酶（CTSD、CTSL、CTSV、AEP）在6小时的孵育中表现不同，AEP和CTSD能产生全部四种saposin，CTSL能产生SapA和SapD，而CTSV仅产生SapD。量化分析显示，SapA通常是最早出现的saposin，而SapC往往是最后产生的。切割模式表明，PSAP的首次切割通常发生在SapA和SapB之间，产生SapA和三聚saposin BCD；较少发生在SapB和SapC之间；而首次切割发生在SapC和SapD之间的情况罕见。
结果3：组织蛋白酶敲低损害iPSC来源神经元中的PSAP切割
为了验证个体组织蛋白酶在神经元中对PSAP切割的必要性，研究利用CRISPRi技术在iPSC来源的神经元中敲低了CTSL、AEP和CTSD的表达。qPCR证实了敲低效率。蛋白质印迹分析显示，每种蛋白酶的敲低均导致全长PSAP的积累。此外，还观察到SapC抗体检测到的三聚saposin条带显著增加，表明PSAP中间体加工不完全。这些数据表明CTSL、AEP和CTSD是神经元中PSAP加工的主要贡献者。
结果4：源自颗粒体蛋白前体的多颗粒体蛋白片段增强组织蛋白酶D对PSAP的加工
PSAP的结合伴侣PGRN已被证明调节saposin丰度。由于PGRN和MGFs调节CTSD的活性，研究假设PGRN可能通过调节CTSD来影响PSAP切割。体外实验表明，与全长PGRN共孵育会减慢CTSD对PSAP的切割速率，而MGF片段pG影响不大，BAC和CDE则能增加PSAP切割速率，其中CDE效果最为显著，能使CTSD在5分钟内产生saposin。在从SH-SY5Y细胞分离的神经元溶酶体实验中，添加CDE同样增强了PSAP的切割。这表明PGRN衍生的片段如CDE可以在神经元溶酶体中增强PSAP加工。
讨论
本研究系统评估了溶酶体组织蛋白酶切割PSAP的能力、其活性的pH依赖性以及产生特定saposin的能力。研究发现，除了已知的CTSD和CTSB外，CTSE、CTSK、CTSL、CTSS、CTSV、CTSG和AEP也能将PSAP加工成saposin。多数蛋白酶在溶酶体pH下活性最佳，但部分蛋白酶在pH 7.4下也有活性，提示可能存在细胞外切割功能。不同组织蛋白酶的表达具有细胞类型特异性，这意味着体内主导的PSAP加工酶可能因细胞环境而异。
研究首次报道了MGFs对PSAP切割的直接影响，特别是CDE能显著加速CTSD的切割速率。这为理解PGRN如何影响saposin丰度和脂质稳态提供了生化机制。考虑到PSAP和saposin在鞘脂代谢和溶酶体贮积症中的关键作用，阐明负责saposin产生的蛋白酶及其调控机制具有潜在的治疗意义。未来研究体内这些蛋白酶调节PSAP切割的生理意义，尤其是在其细胞类型特异性表达的背景下，将尤为重要。
