《Neurobiology of Disease》：RhoA deletion in macrophages/microglia aggravates blood-brain barrier disruption after ischemic stroke reperfusion injury by promoting endothelial cell apoptosis and pyroptosis
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本研究针对脑缺血再灌注(I/R)损伤后血脑屏障(BBB)破坏的机制难题，通过构建巨噬细胞/小胶质细胞特异性RhoA条件性敲除(cKO)小鼠模型，首次揭示RhoA缺失通过促进M1型极化增强促炎因子分泌，进而通过NLRP3通路诱导内皮细胞焦亡(pyroptosis)和凋亡(apoptosis)，最终加剧BBB破坏。该发现挑战了传统RhoA抑制治疗的观念，为缺血性卒中提供了新的细胞靶向治疗策略。
在脑卒中治疗领域，缺血再灌注损伤一直是困扰临床医生的难题。当血栓被溶解，血液重新流入缺血脑组织时，反而会引发更严重的二次损伤，这其中血脑屏障的破坏被认为是关键环节。传统观点认为RhoA作为细胞骨架调节因子，其激活会加剧病理过程，因此RhoA抑制长期被视为有前景的治疗策略。然而令人困惑的是，针对RhoA的 pharmacological inhibitors在临床试验中并未展现出预期疗效，这一矛盾现象提示我们：RhoA在不同细胞类型中可能扮演着截然不同的角色。
近日发表在《Neurobiology of Disease》的研究论文首次揭示巨噬细胞/小胶质细胞中RhoA上调实际上是机体的自我保护机制。研究人员通过生物信息学分析发现，在脑缺血再灌注组织中，巨噬细胞/小胶质细胞的RhoA表达显著升高。为探究其功能意义，团队成功构建了巨噬细胞/小胶质细胞特异性RhoA条件性敲除小鼠模型(Lyz2Cre/+;RhoAflox/flox)。
关键技术方法包括：利用大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)和LPS诱导的BBB损伤模型；通过Evans blue和FITC-dextran渗漏实验评估BBB通透性；采用原代骨髓来源巨噬细胞(BMDM)和小胶质细胞培养进行体外机制研究；运用RNA测序分析基因表达谱；通过Western blot和免疫荧光检测关键蛋白表达；使用NLRP3特异性抑制剂MCC950进行干预验证。
研究结果部分：
3.1. RhoA在缺血再灌注损伤后的巨噬细胞/小胶质细胞中表达上调
通过分析公共数据库和实验验证，研究人员发现I/R损伤后缺血半球的巨噬细胞/小胶质细胞中RhoA表达显著升高，提示其可能参与I/R损伤进程。
3.2. 巨噬细胞/小胶质细胞中RhoA缺失加重I/R损伤
与Cre对照组相比，cKO小鼠表现出更大的梗死体积、更严重的神经功能缺损和神经元损失，表明巨噬细胞/小胶质细胞RhoA在I/R损伤中发挥保护作用。
3.3. 巨噬细胞/小胶质细胞中RhoA cKO加剧I/R损伤后的BBB破坏
cKO小鼠在I/R后显示更严重的Evans blue和dextran渗漏、脑水肿加重，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表达下降，证实RhoA缺失通过破坏BBB完整性加重损伤。
3.3.1. RhoA cKO巨噬细胞或小胶质细胞的条件培养基降低内皮细胞紧密连接蛋白并增加焦亡和凋亡蛋白
体外实验表明，RhoA cKO巨噬细胞/小胶质细胞的条件培养基能显著降低内皮细胞紧密连接蛋白表达，同时激活凋亡和焦亡通路，而不影响增殖、铁死亡或铜死亡。
3.4. RhoA缺失促进小胶质细胞的促炎极化谱
转录组分析显示RhoA缺失导致小胶质细胞向M1型极化，促炎因子IL-6、TNF-α分泌增加，抗炎因子表达下降，这可能是导致内皮细胞损伤的重要原因。
3.5. NLRP3抑制剂MCC950逆转RhoA cKO巨噬细胞或小胶质细胞CM诱导的内皮细胞凋亡、焦亡和紧密连接蛋白丢失
MCC950处理能显著抑制NLRP3炎症小体活化，减少焦亡和凋亡相关蛋白表达，恢复紧密连接蛋白水平，证实NLRP3通路在此过程中的关键作用。
3.6. MCC950逆转RhoA cKO小鼠I/R损伤后的体内BBB损伤
在体实验进一步验证MCC950能减轻cKO小鼠的梗死体积，改善神经功能，恢复BBB完整性，为靶向NLRP3的治疗策略提供实验依据。
研究结论与讨论部分强调，该研究挑战了RhoA抑制 universally beneficial的传统观念，首次揭示巨噬细胞/小胶质细胞RhoA上调通过抑制NLRP3介导的内皮细胞焦亡和凋亡，在维持BBB完整性中发挥保护作用。这一发现不仅阐明了细胞特异性RhoA功能的复杂性，也为缺血性卒中治疗提供了新的靶点策略。研究人员指出，未来治疗策略可能需要采用更精准的细胞靶向方法，而非广泛的RhoA抑制，同时需要考虑性别差异、老龄化等影响因素，以推动研究成果向临床转化。
这项研究的重要意义在于揭示了免疫细胞与血管内皮细胞之间新型对话机制，为理解脑缺血再灌注损伤的病理生理过程提供了新视角，对开发针对血脑屏障保护的治疗策略具有重要指导价值。
