《Neurobiology of Disease》：Distinct Argonaute2-associated small RNA profiles in microglia and neurons drive cell-specific responses in a mouse model of temporal lobe epilepsy
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为破解“癫痫脑内谁在说RNA”难题，团队利用Thy1/Cx3cr1-FLAG-Ago2双转基因鼠，首次绘制癫痫发生与慢性期小胶质细胞与神经元的RISC-miRNA/tRF动态图谱，发现早期反应由小胶质细胞主导、慢性期两细胞各唱各调，miR-21a-5p虽共享却走不同通路。结果提示细胞特异性干预miRNA/tRF或成癫痫精准治疗新策略。
癫痫为何一旦点燃便难以熄灭？问题藏在细胞“暗语”里。传统 bulk 测序把神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞等混为一谈，结果只能看到一团乱麻：miRNA 升高或降低，却不知是谁在表达；tRNA 片段（tRF）新近被证可进入 RNA 诱导沉默复合体（RISC）调控翻译，却无人知道癫痫脑内哪类细胞在用这些“暗号”。更棘手的是，有些 miRNA 如 miR-21a-5p 在多种细胞里同步升高，它究竟帮谁说话、说给谁听，决定生死还是沉默，一直悬而未决。若无法把“谁、何时、调控什么”拆到单细胞水平，精准干预便无从谈起。
为回答上述难题，爱尔兰皇家外科医学院与都柏林大学学院联合团队在《Neurobiology of Disease》发表研究，利用可诱导、细胞特异性表达 FLAG 标签 Argonaute2（Ago2）的转基因小鼠，把 RISC“钓”出来，直接测序其携带的小 RNA，首次在活体水平拆解癫痫发生 24 h 与慢性 2 周时小胶质细胞与神经元的 miRNA/tRF 时空动态，并验证 miR-21a-5p 的细胞特异性功能。
关键技术方法：① 构建 Thy1-Cre 与 Cx3cr1-Cre 分别驱动神经元和小胶质细胞 FLAG-Ago2 表达的转基因小鼠；② 杏仁核内注射海人酸（IAKA）建立颞叶癫痫（TLE）模型；③ FLAG 免疫沉淀富集 RISC，配对小 RNA-seq；④ Hexb 报告鼠结合 FACS 分选，行 RNA-seq 验证 miR-21a-5p 靶基因；⑤ 脑室内注射 antimiR-21a-5p 反义寡核苷酸评估功能。
研究结果
3.1 癫痫发生早期由小胶质细胞主导的小 RNA 应答
RISC-seq 显示 24 h 时仅小胶质细胞出现显著差异 Ago2 结合 miRNA，包括炎症相关 miR-155-5p、miR-146a-5p 及癫痫明星分子 miR-21a-5p；神经元未见显著变化。Scatter plot 发现小胶质细胞存在“产量高但装载少”或“产量不变却特异装载”两类 miRNA，提示存在独立于表达总量的选择性加载机制。
3.2 慢性癫痫期神经元与小胶质细胞均发生广泛 RISC 重塑
2 周时，两类细胞均出现大量差异 Ago2-miRNA：小胶质细胞持续高载 miR-155-5p、miR-146a-5p；神经元则出现促兴奋 miR-132-3p、miR-129-5p、miR-212-3p 等。miR-21a-5p 此时在两种细胞中同时升高，显示时间-细胞双重动态。整体水平与 RISC 装载相关性减弱，提示慢性期存在选择性加载或排斥机制。
3.3 两细胞纵向轨迹分道扬镳
整合分析显示，小胶质细胞与神经元的 Ago2-miRNA 谱呈“分道扬镳”格局，无共同疾病签名。DIANA 通路预测：小胶质细胞靶基因富集 TLR 信号、细胞因子；神经元则富集轴突导向、TGF-β 信号及染色质重塑，提示功能需求不同。
3.4 tRNA 片段处理亦呈细胞-疾病双特异性
PCA 显示 tRF 谱首先按细胞类型分离，其次才反映疾病状态。24 h 时小胶质细胞 tRF 以 31–34 nt 的 tRNA halves 为主；慢性期则向更短 5′tRF、itRF 偏移，提示切割/稳定性重塑。神经元 tRF 变化幅度小，但个别 tRNA（Ala-AGC、Asn-GTT）呈治疗依赖性片段化差异。整体差异表达 tRF 同样以小胶质细胞占主导。
3.5 miR-21a-5p 细胞特异性靶基因与功能
利用 Hexb 鼠在 SE 后 2 h 脑室注射 antimiR-21a-5p，24 h 后分选 microglia 与“其他细胞”行 RNA-seq。结果显示 miR-21a-5p 抑制后，两类细胞差异表达基因仅 8% 重叠。GO 分析：小胶质细胞上调溶酶体与代谢通路，提示向吞噬/稳态表型倾斜；其他细胞则解除炎症信号抑制。说明同一 miRNA 在不同细胞中走不同“通路”，功能效应可互补。
研究结论与讨论
该研究首次在单细胞 RISC 层面揭示：① 癫痫发生后 24 h 的小 RNA“风暴”主要由小胶质细胞驱动，神经元反应延迟；② 慢性期两细胞持续各行其是，无统一疾病签名；③ miRNA 总体丰度与 RISC 装载可脱节，提示转录后加工/选择性加载机制活跃；④ tRF 与 miRNA 并行参与细胞特异性调控，慢性癫痫伴随 tRNA 片段长度谱重塑；⑤ 看似“通用”的 miR-21a-5p 在不同细胞中调控不同靶集，抑制它可同时抑制炎症并促进小胶质细胞稳态，为“一箭双雕”提供依据。
意义在于：为癫痫等小 RNA 疗法提供了“细胞-时间-分子”三维坐标，警示未来临床试验若不加区分地递送 miRNA 药物，可能激活对立通路；同时也提示联合靶向 miRNA 与 tRF、或细胞特异性递送，有望突破现有疗效瓶颈。
