《Neurobiology of Sleep and Circadian Rhythms》：Toward dissection of diverse neural components in the suprachiasmatic nucleus (SCN) pacemaker network
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本文聚焦于哺乳动物下丘脑视交叉上核（SCN）这一中枢起搏器的细胞异质性难题。SCN由约20,000个神经元组成，表达多种神经递质/神经肽，如何在此多样性网络中维持精确的~24小时节律并作为中枢起搏器调控行为与生理过程的昼夜节律，是领域内的核心科学问题。研究人员利用条件性基因敲除等神经技术，靶向特定细胞类型进行遗传操作和成像，旨在揭示SCN网络中不同细胞振荡器的独特作用、分类、连接及同步机制，以及它们如何在外界光暗周期下实现细胞类型水平的授时。该研究对理解昼夜节律的细胞和网络基础具有重要意义。
在哺乳动物的大脑中，有一个微小的区域肩负着至关重要的使命——它如同身体的“主时钟”，负责产生并协调近24小时的昼夜节律，调控着从睡眠-觉醒周期到激素分泌、新陈代谢等众多生理过程。这个神奇的结构就是位于下丘脑的视交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus, SCN）。然而，这个中枢起搏器并非由单一、均质的细胞群体构成。相反，它是一个由约20,000个神经元组成的复杂网络，这些神经元在神经递质和神经肽的表达、解剖位置、电生理特性及功能上均表现出显著的异质性。SCN神经元主要释放γ-氨基丁酸（GABA），但其多样性主要体现在所共表达的各种神经肽上，如精氨酸加压素（Arginine Vasopressin, AVP）、血管活性肠肽（Vasoactive Intestinal Peptide, VIP）、胃泌素释放肽（Gastrin-Releasing Peptide, GRP）等。这就引出了一个核心谜题：一个由如此多样化的细胞身份组成的网络，是如何实现高度精确和稳健的同步振荡，并作为一个协调的整体来发挥功能的？是否存在某些特定的神经元亚群，在这个起搏器网络中扮演着更为关键的角色？为了回答这些问题，科学家们正致力于解析SCN网络中不同的神经组分。
传统上，根据神经肽的表达和解剖位置，SCN被大致划分为背内侧“壳”区和腹外侧“核心”区。壳区主要由产生AVP的神经元主导，而核心区则富含表达VIP和GRP的神经元。这两个分区在连接上也存在差异：核心区直接接收来自视网膜的光输入，而壳区则被认为接收来自核心区的输入，并向其他下丘脑核团发出投射。这种解剖和分子上的划分为利用条件遗传学方法靶向SCN特定神经元群体提供了基础。然而，免疫组织化学方法仅能鉴定约79%的SCN神经元，而且许多神经元共表达多种神经肽，或在同一肽能神经元类别内存在进一步亚型分化。近年来，转录组学分析，特别是单细胞RNA测序技术，将SCN神经元进一步细分为5-11种亚型，这些亚型主要与神经肽基因、其同源受体及信号因子相关。尽管SCN内基因表达的多样性十分显著，但其主要功能可能仍集中于几个关键节点。
为了剖析SCN这个异质性主起搏器网络，研究人员发展并应用了多种遗传策略。核心工具是Cre重组酶或四环素控制的转录激活因子（Cre/tTA）的小鼠驱动品系，以及与条件性基因操作（如条件性敲除、报告基因表达、光遗传学、化学遗传学）相结合的小鼠品系。目前已有多种驱动小鼠品系用于SCN研究，例如相对广泛表达的Syt10-iCre、Camk2a-iCre，以及更具细胞类型特异性的驱动品系，如靶向AVP神经元的Avp-Cre/Avp-iCre、靶向VIP神经元的Vip-ires-Cre、靶向GRP神经元的Grp-Cre等。这些工具使得在特定SCN神经元亚群中操纵核心时钟基因（如Bmal1）或其他信号分子成为可能，从而揭示这些细胞在整体网络节律产生和维持中的独特贡献。
研究表明，不同的神经肽和相应的神经元亚群在SCN网络中扮演着 distinct 角色。例如，AVP-V1a/b信号通路在正常情况下对SCN网络节律的贡献相对较弱，但在抵御外界环境（如模拟时差的8小时光周期提前）急性变化时，它起着“稳定器”的作用。相比之下，VIP信号对于SCN内部的同步性至关重要。敲除Vip或其受体Vipr2会导致SCN神经活动和基因表达节律的失同步。值得注意的是，虽然VIP的急性应用能诱导节律相位移动，但其持续应用反而会去同步化SCN节律并降低振荡幅度。此外，针对NMS（Neuromedin S）神经元或DRD1a（多巴胺受体D1a）神经元等特定亚群的操作，也能显著影响整体的昼夜行为节律和SCN网络同步性，即使这些操作仅覆盖SCN部分神经元（如NMS-iCre靶向约40%的SCN神经元）。这些发现强烈提示，SCN网络中存在某些关键节点或神经元亚群，对维持网络的整体协调性具有不成比例的重要影响。
在技术方法上，研究不仅依赖于条件性基因敲除（loss-of-function），也采用改变昼夜节律周期（如过表达周期突变基因）等功能获得性（gain-of-function）策略。此外，除了分析整体行为节律，利用钙成像、多电极记录等技术在离体脑片或活体水平记录SCN神经元群体的电活动或分子振荡，为了解网络同步性提供了直观证据。例如，在应用河豚毒素（TTX）阻断神经活动后撤除药物，可以观察SCN网络如何重新建立同步，并借此绘制神经元间的“功能连接”图谱，发现更强的耦合集中在中央核心区。
该研究主要应用了几项关键技术方法：1）利用多种细胞类型特异性Cre/tTA驱动小鼠品系进行条件性遗传操作，这些驱动品系包括转基因和基因敲入等不同构建策略，靶向SCN内不同的神经肽能神经元亚群（如AVP、VIP、NMS、GRP、CCK神经元等）。研究所用小鼠样本多基于C57BL/6等背景品系。2）采用行为学分析（主要是小鼠运动活动节律监测）作为评估整体昼夜节律功能的核心输出指标。3）运用离体SCN脑片培养结合实时基因表达报告系统（如PER2::LUC生物发光成像）或钙成像技术，在组织水平评估SCN网络的分子节律或电生理节律及其同步性。4）通过免疫组织化学、原位杂交、单细胞qPCR或单细胞RNA测序等技术进行细胞分类、定位和分子表征。
2.1. 神经肽表达定义的神经身份
研究表明，SCN神经元经典上根据其表达的神经递质和神经肽进行分类。几乎所有SCN神经元都是GABA能的。接下来最普遍的两种神经肽是AVP和VIP。AVP神经元约占SCN神经元的20%，其基因表达具有昼夜节律性，受核心时钟组件CLOCK/BMAL1通过E-box元件调控。VIP神经元约占10%，与AVP神经元基本不重叠，因此常分别作为核心区和壳区的标志物。外源性VIP能在体内外诱导节律相位移动，故VIP神经元被认为介导光授时过程。此外，SCN中存在超过100种其他神经肽，其中GRP被认为是核心区的主要神经肽之一，但GRP神经元仅占约4.5%，且部分与VIP神经元共表达。与VIP在光刺激下表达下调不同，GRP在光暴露后逐渐增加，提示即使VIP和GRP神经元有重叠，GRP也可能存在独特的授时机制。
2.2. 转录组学等定义的神经身份
免疫组织化学仅能识别约79%的SCN神经元。即使在同一种肽能神经元内也存在亚类，例如VIP神经元根据基因表达差异或电生理特性可进一步分为两种亚型。此外，神经肽的表达水平会因光周期等环境因素而改变。近年来，转录组分析（包括单细胞RNA测序）将SCN神经元分为5-11种亚型，主要与神经肽基因、其受体及信号因子相关。这表明，尽管SCN内基因表达多样，但其主要功能角色可能集中于几个关键节点。
3.1. SCN神经元条件性操作的一般驱动品系
目前尚无完全SCN特异性的驱动品系。常用的驱动品系包括Syt10-iCre（表达于约90%的SCN神经元，但纯合子为Syt10敲除，且雄性存在种系表达）、Camk2a-iCre（出生后P3开始表达，靶向约90%的SCN神经元）、Six3-Cre（胚胎期E9.0-9.5开始表达，可能影响SCN发育）、Rora-ires-Cre（胚胎期E14.5开始表达）、Vgat-ires-Cre（靶向GABA能神经元）等。这些驱动品系在SCN内的表达范围、时间以及自身可能存在的表型（如影响发育、种系重组等）需在选择和使用时仔细考量。
3.2. SCN神经元的细胞类型特异性驱动品系
针对特定神经肽或受体的驱动品系不断增多。例如，Scg2-tTA可用于在tet-off系统中高效过表达外源基因。Nms-iCre转基因小鼠的Cre表达主要局限于SCN，但不覆盖整个SCN，即使仅靶向约40%的SCN神经元，敲除floxed Bmal1也会导致几周后运动活动节律丧失。针对AVP、VIP、CCK、GRP、Drd1a等神经元的多种Cre品系（如Avp-Cre, Vip-ires-Cre, Cck-ires-Cre, Grp-Cre, Drd1a-Cre等）已被开发和应用，它们基于不同的构建策略（BAC转基因、基因敲入等），具有不同的表达特异性和潜在表型（如某些基因敲入品系纯合子即为该基因敲除，某些IRES插入品系可能导致内源基因表达减弱即亚效等位基因）。
4.1. 神经肽在起搏器神经元同步中的作用
AVP信号缺失对行为节律的影响较轻微，但其受体V1a/b缺失或药理学阻断后，其对行为节律和SCN节律的贡献变得明显，例如在模拟时差实验中，缺失V1a/b的小鼠能更快地重新适应新的光暗周期，表明AVP-V1a/b通路起到稳定网络、抵御急性环境变化的作用。VIP对于SCN内部的同步性至关重要，敲除Vip或Vipr2会导致SCN神经活动和基因表达节律失同步。共培养实验证明内源性释放的VIP可以恢复Vip敲除SCN的同步振荡。持续应用VIP则会去同步化SCN节律并降低振幅。这些发现提示VIP信号在维持网络同步中的关键作用，但其与下游分子振荡器的相互作用及在特定SCN神经元相位重置中的角色仍需深入探索。
4.2. 网络水平的神经肽信号
神经肽在网络水平的作用复杂，一种神经肽的表达会影响其他神经肽。例如，敲除Vip会减弱SCN中AVP的表达。当VIP表达减少时，AVP在维持SCN节律中的作用变得明显。这表明神经肽信号之间存在交互且层级式的相互作用。神经肽受体基因的表达为推断SCN内部通信的方向性提供了线索。例如，VIPR2在背内侧区富集，与约50%的AVP神经元共定位，也表达于约30%的VIP神经元，提示VIP既能刺激AVP神经元（核心到壳方向），也能刺激VIP神经元自身。而AVP受体V1a和V1b在SCN的前后轴差异表达，提示AVP可能主要参与壳区内部或其他信号网络。
5.1. SCN神经元中时钟基因的选择性敲除
利用条件性基因操作技术，研究试图揭示特定SCN神经元类别在节律性决定中的可能贡献。例如，在NMS神经元（约占SCN神经元40%）中敲除Bmal1或过表达Per2，会导致在恒定黑暗条件下几周后 coherent 昼夜行为节律丧失，并破坏SCN中的网络节律同步性。在DRD1a神经元中操纵昼夜节律周期也会改变中枢起搏器的周期。在VIPR2神经元中特异性敲除Bmal1或操纵节律周期，即使Cre表达在腹侧VIP神经元中缺失，也会诱导行为节律失常或改变行为周期。这些结果表明SCN神经元亚群对网络功能有贡献，但仍需进一步解析。
5.2. SCN神经元的细胞类型特异性操作
操纵AVP神经元的昼夜节律周期（通过删除或过表达CK1δ）会改变行为节律。而在AVP神经元中删除Bmal1会导致行为周期延长而非消失，并引起Avp、Prok2等重要信号基因表达下降，壳区神经元分子节律紊乱，这被认为是由于细胞间通信受损和正常网络解耦所致。VIP神经元在光授时中起关键作用，但其在默认昼夜节律网络中的完整角色尚不完全清楚。消融VIP神经元会导致SCN整体相位去同步化和节律振幅减弱。在离体脑片中激活完整的VIP神经元会降低SCN的振荡幅度和延长全局周期，但在体操纵VIP神经元的昼夜节律周期对行为没有影响。CCK神经元在体表现出强劲的钙活动节律，其峰值在长日照条件下更接近运动活动开始时间。GRP神经元消融对行为节律和光授时没有影响，但刺激时可诱导节律相位移动。
5.3. 单细胞振荡器的耦合
分散的单个SCN神经元能维持昼夜节律，但表现出广泛的相位和周期差异，约50-70%的分离神经元甚至没有清晰的节律性。当SCN神经元形成网络后，这些变异在脑片制备中显著减少，并在整体行为水平上进一步巩固，从而获得更高的精确性和稳定性。细胞间耦合机制缩小了细胞间和区域间的差异，使SCN能够作为一个协调的中枢起搏器发挥作用。除了神经肽，电耦合也提供了另一种SCN网络整合方式。TTX阻断钠通道会导致振荡幅度减小和神经元间失同步，撤除TTX后SCN能重新建立同步性，且再同步化过程从腹侧SCN开始并向背侧SCN传播。功能连接图谱显示，更强的耦合集中在中央核心区，该区与外围壳区的连接稀疏。
综上所述，这篇发表在《Neurobiology of Sleep and Circadian Rhythms》上的综述系统总结了在解析SCN这一中枢生物钟网络的细胞组成和功能机制方面的最新进展。研究强调SCN并非均质结构，而是由多种具有特定神经化学特性、连接模式和潜在功能的神经元亚型构成的复杂网络。通过利用不断丰富的细胞类型特异性遗传工具，研究开始揭示不同神经元亚群（如AVP、VIP、NMS、DRD1a等神经元）在产生、维持和调节昼夜节律中的独特和协同作用。这些发现对于理解大脑如何整合多样化的细胞振荡器成为一个稳健而灵活的计时系统至关重要。该研究领域的发展不仅深化了对生物钟基本工作原理的认识，也为理解与昼夜节律紊乱相关的睡眠障碍、情绪问题、代谢疾病等提供了潜在的细胞和环路水平的解释框架。未来的研究将继续借助新的技术手段，如空间转录组学、更精确的遗传操作工具和高分辨率活体成像等，进一步阐明SCN网络中细胞类型特异性振荡器的详细功能、它们之间的相互作用规则，以及它们如何协调以应对环境挑战并调控下游生理过程。
