《Neuroscience》：An ALS-associated mutant SOD1 protein can be eliminated in microglia culture by selective autophagy
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家族性肌萎缩侧索硬化症（fALS）中突变SOD1蛋白通过选择性自噬在微胶质中被清除，其机制涉及WDFY3蛋白共定位及自噬功能调控，同时野生型与突变型SOD1均被分泌至胞外。
Kumiko Murakami | Norihiro Sudou | Atushi Kurata | Motoko Kawaguchi-Niida
东京女子医科大学病理学系，日本东京新宿区川田町8-1，邮编162-8666
摘要
家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关突变型锌超氧化物歧化酶1（SOD1）蛋白的获得性毒性已被证实与运动神经元死亡有关，在运动神经元、星形胶质细胞和神经元轴突的细胞质中观察到了聚集物或包含体，但在小胶质细胞中未观察到这些现象。本研究阐明了突变型SOD1为何不会在小胶质细胞中聚集以及如何被清除的机制。我们构建了带有Venus标签的pcDNA3-SOD1载体：野生型SOD1和突变型SOD1作为对照，A4V、D90A和G93A SOD1突变体作为疾病相关载体；这些质粒被引入Ra2小胶质细胞系中进行后续评估。从无症状的G93A小鼠脊髓中收集的数据表明，突变型SOD1蛋白在小胶质细胞中的聚集非常少，这与先前的研究结果一致。我们的新发现基于免疫组化、Western blot和酶免疫测定分析，结果显示突变型SOD1在小胶质细胞中的表达显著低于野生型SOD1。此外，我们观察到在自噬抑制实验中突变型SOD1蛋白水平有所恢复，并且它与选择性自噬相关蛋白WDFY3共定位。这些体外结果表明，只有突变型SOD1蛋白（而非野生型SOD1）会被选择性自噬降解。我们还发现野生型和突变型SOD1都会直接从小胶质细胞中分泌。这些发现为阐明小胶质细胞在ALS病理过程中如何处理突变型SOD1蛋白提供了机会，并可能有助于改进ALS的治疗策略。
引言
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种病因不明的疾病，主要发生在中年及以后，其特征是上运动神经元和下运动神经元的选择性和进行性退化及丧失。疾病进展相对较快，通常在未使用呼吸机的情况下2-5年内导致死亡。大约10%的ALS病例是家族性的，其中20%的家族性ALS（fALS）病例与编码Cu、Zn超氧化物歧化酶1（SOD1）的基因突变有关（Ince等人，2011年；Rowland和Shneider，2001年）。据报道，SOD1突变引起的fALS是由SOD1的毒性获得性功能增强突变引起的（mSOD1）；然而，其具体机制尚不清楚。
许多研究表明，运动神经元的死亡并非独立于细胞发生，而是涉及运动神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和浸润的T细胞的协同反应。这些细胞会经历神经炎症，表现为星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖、细胞因子的产生和释放、兴奋性毒性及氧化应激，从而导致ALS患者的运动神经元死亡（Alexianu等人，2001年；Almer等人，1999年；Corona等人，2007年；Deora等人，2020年；Henkel等人，2004年；Kawaguchi-Niida等人，2013年；Neusch等人，2007年；Reynolds等人，2007年）。
据认为与获得性毒性相关的mSOD1会形成聚集物。这些SOD1聚集物是家族性ALS的特征，组织学上表现为含有mSOD1蛋白聚集物的细胞质包含体（Rouleau等人，1996年；Shibata等人，2008年）。这些SOD1聚集物/包含体存在于许多ALS患者的神经元和星形胶质细胞中，以及ALS小鼠模型（如G93A-mSOD1和其他突变型SOD1小鼠系，如G37R和G85R）的病理病变中。总体而言，已有报道指出mSOD1聚集物存在于ALS患者和ALS小鼠模型的神经元和星形胶质细胞的细胞质中（Watanabe等人，2001年；Wang等人，2002年）。然而，据我们所知，几乎没有关于它们在少突胶质细胞或小胶质细胞细胞质中定位的报道。
在表达mSOD1的小鼠模型和人类患者中，小胶质细胞表现出增殖增加，并通过激活和产生促炎基因产物（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、干扰素-γ（IFN-γ）、活性氧（ROS）、趋化因子和谷氨酸等分子来促进ALS的病理进程（Li等人，2011年；Shibata等人，2008年）。关于小胶质细胞的参与，体外研究表明细胞外的mSOD1会刺激小胶质细胞并释放神经毒性超氧化物相关细胞因子（如TNF-α），从而引发神经毒性（Roberts等人，2013年；Zhao等人，2010年）。然而，关于小胶质细胞如何避免细胞内mSOD1的影响，以及在这些细胞培养物、动物模型和人类患者中为何形成较少的SOD1聚集物，目前知之甚少。
mSOD1蛋白要么被释放到细胞外，要么在细胞质中被降解，从而保护细胞免受其影响。泛素-26S蛋白酶体和自噬-溶酶体系统是参与细胞质蛋白降解的主要途径。大自噬被认为是由于营养缺乏引起的批量降解过程。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，进而降解被隔离的成分（Mizushima，2007年）。Isakson等人报告称，自噬是一个高度选择性的过程，当选择性自噬针对易聚集的蛋白质进行降解时，这一过程被称为聚集自噬（Isakson等人，2013年）。某些聚集的蛋白质会被泛素和p62修饰，并与执行选择性自噬的分子WD重复序列和FYVE结构域蛋白3（WDFY3，也称为自噬相关FYVE蛋白（ALFY））相互作用，这些分子被隔离在磷脂乙醇胺（LC3A）阳性的微管相关蛋白轻链3修饰的自噬体中，随后发生选择性降解（Isakson等人，2013年；Sasaki，2011年）。新的证据表明，自噬参与了ALS的发病机制。先前的研究已在散发性ALS患者的脊髓运动神经元以及携带G93A mSOD1的小鼠中发现了自噬体的存在（Han等人，2015年；Morimoto等人，2007年；Sasaki，2011年）。本研究旨在探讨ALS相关mSOD1蛋白如何在培养的小胶质细胞中通过选择性自噬被清除的机制。
实验部分
动物
本研究获得了东京女子医科大学动物研究伦理委员会的批准。实验所用小鼠（雄性或雌性）过表达G93A mSOD1转基因（高表达的G1H系（G1H+/-）（G93A小鼠）（Gurney，1994年）和非转基因同窝小鼠（背景品系，Jackson Laboratory系）（SJL小鼠）来自美国缅因州Bar Harbor的Jackson Laboratory。G93A小鼠表达人源转基因mSOD1和内源性野生型小鼠SOD1，而SJL小鼠仅表达...
转染了Venus标签的野生型基因的培养星形胶质细胞和小胶质细胞
准备了野生型SOD1以及与ALS相关的A4V、D90A和G93A突变型SOD1（表1；图2A、B）。过表达G93A突变型SOD1的小鼠系是最常用的实验模型，用于表征ALS症状。表达其他突变型SOD1基因（如A4V和D90A）的转基因小鼠也表现出运动系统的进行性神经退化和类似ALS患者的症状。
讨论
多项研究表明，ALS相关的SOD1突变体具有毒性获得性功能（Bruijn等人，1998年；Nagai等人，2007年；Zhao等人，2010年）。在本研究中，我们检测了转染了野生型或几种ALS相关突变型SOD1质粒的小胶质细胞中SOD1蛋白的亚细胞定位和表达水平。在基因转移过程中，突变型SOD1的水平在细胞质可溶性 fraction中暂时增加，但24小时后...
作者贡献
Murakami K、Sudou N和Niida MK进行了实验。Kurata和Niida分析了获得的数据。所有作者均参与了手稿的撰写。本研究由Niida MK设计和实施。
资助和支持
本研究得到了庆应义塾大学的研究鼓励奖和东京女子医科大学的Satake Takako鼓励基金的支持。此外，还得到了东京女子医科大学医学研究所的支持。
CRediT作者贡献声明
Kumiko Murakami：概念构思、数据管理、形式分析、研究设计、方法学。
Norihiro Sudou：数据管理、形式分析、研究设计、方法学、资源提供、软件使用。
Atushi Kurata：监督、结果验证。
Motoko Kawaguchi-Niida：监督。
伦理批准和参与同意
本研究获得了东京女子医科大学委员会的批准。所有实验和动物处理程序均遵循该机构的相关指南和规定。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究。
致谢
我们感谢Shibata N提供的宝贵讨论和建议。同时感谢Sawada M提供Ra2小胶质细胞系。
