从一种附着于珊瑚藻的真菌菌株中分离出的含有氯的聚酮类化合物，具有抗神经炎症和抗血管生成活性 Diaporthe middletonii Km3279

《Phytochemistry》：Chloro-containing polyketides with anti-neuroinflammatory and anti-angiogenic activities from a coralline algicolous fungal strain Diaporthe middletonii Km3279

本研究从台湾金门岛海带中分离出真菌Diaporthe middletonii Km3279，通过OSMAC策略发酵提取，获得7个新化合物（diaportonicins A–G）及5个已知化合物。其中，化合物5、8、11、12显著抑制小鼠微胶质BV-2细胞NO生成（IC50 0.58-9.86 μM），化合物5、7、9抑制内皮祖细胞管状形成（IC50 5-26 μM），并揭示其生物合成途径。

　　

廖一飞|萧乔治|王世伟|池伟忠|程远忠|黄淑贞|刘志毅|王永松|李宗辉

台湾国立大学生命科学学院渔业科学研究所，台北106319，台湾

摘要

在本研究中，从台湾金门县利宇乡采集的珊瑚藻Corallina declinata中分离出一种名为Diaporthe middletonii Km3279的真菌菌株，并对其进行了鉴定。采用OSMAC（一种菌株，多种化合物）策略进行了液体发酵，培养条件包括淡水马铃薯葡萄糖肉汤、含17‰盐分的微咸水以及添加了麦芽提取物（ME）的培养基，或者添加了0.03%碘化钾的淡水ME培养基，发酵时间为14至21天。发酵结束后，所有培养液均用乙酸乙酯提取。所得干燥提取物依次通过Sephadex LH-20开管色谱、中压液相色谱和高性能液相色谱进行分离和纯化。这一过程最终分离并鉴定了7种先前未报道的多酮类化合物，命名为diaportonicins A–G（1–7），以及5种已知化合物：periconsin D（8）、cryptosporiopsinol（9）、periconsin B（10）、periconsin E（11）和(S)-6-hydroxymellein（12）。在抗神经炎症实验中，化合物5、8、11和12对小鼠小胶质细胞BV-2中的一氧化氮生成表现出强烈的抑制作用，其IC₅₀值分别为1.39 ± 0.26、0.58 ± 0.07、9.86 ± 1.91和6.19 ± 1.30 μM，并且没有检测到细胞毒性。此外，化合物5、7和9通过抑制内皮祖细胞的管状形成表现出中等到强的抗血管生成活性，其IC₅₀值分别为8.00 ± 1.00、5.00 ± 1.00和26.00 ± 2.00 μM。同时，还提出了化合物1–11的潜在生物合成途径。

引言

海洋卤代天然产物（HNPs）是含有卤素（主要是溴和氯）的次级代谢物（Chen, Xu等人，2022），这些化合物在海洋环境中非常丰富（Gozari等人，2021）。它们主要由海洋海绵、藻类、细菌和真菌产生，目前已鉴定出超过10,000种。值得注意的是，大多数来自真菌的海洋HNPs含有氯元素（Cochereau等人，2022）。适应极端环境条件（如高压、低氧和高盐度）的海洋真菌通常具有独特的代谢途径。这些适应性使得它们能够产生结构新颖且具有多种生物活性的代谢物，包括抗菌（Chen等人，2016；Zhou等人，2016）、抗炎（Gu等人，2019；Zhang等人，2009）和抗癌特性（Chen等人，2016；Frank等人，2019；Yasuhide等人，2008）。因此，能够产生特殊HNPs的海洋真菌成为药物开发的重要来源，尤其是考虑到大约25%的临床用药含有卤素，这凸显了这类化合物的药理学重要性（Chen, Xu等人，2022；Gozari等人，2021）。

OSMAC（一种菌株，多种化合物）是一种广泛使用且有效的策略，通过系统地改变培养条件来扩展真菌次级代谢物的化学多样性。这些改变包括营养成分的调整、物理参数（如温度、pH值和盐度）的调整、共培养策略的改进以及卤化盐的添加（Romano等人，2018）。特别是，添加NaBr和KI等盐分已被证明可以分别诱导某些真菌菌株合成溴化和碘化代谢物（Chen等人，2019；Chen, Yang等人，2022；Frank等人，2019），从而增强结构多样性和化学新颖性。

珊瑚藻Corallina declinata（Corallinaceae科）栖息在低潮带，它附着在岩石上，能够耐受强烈的海流、强烈的阳光、盐度波动和水压变化等恶劣环境条件。这种藻类从海水中吸收钙质物质，从而强化其骨架结构并减少有机成分，降低了其作为海洋动物的食物价值（Hind和Saunders，2013）。此外，它在这种极端条件下的生存能力可能与能够产生特殊代谢物的内生和附生微生物的高度多样化群落有关（El-Bondkly等人，2021）。因此，本研究重点调查了与C. declinata相关的真菌菌株产生的天然产物，旨在鉴定具有生物活性的化合物。

在本研究中，从C. declinata中分离并鉴定了Diaporthe middletonii Km3279（Diaporthaceae科）菌株。采用OSMAC策略进行液体发酵，鉴定出了12种次级代谢物，其中包括6种氯化化合物。本文介绍了这些先前未报道的化合物的分离和结构鉴定结果，并评估了它们的抗神经炎症和抗血管生成活性。

部分内容摘录

先前未报道化合物的结构解析

从D. middletonii Km3279的发酵液中提取的乙酸乙酯提取物依次通过Sephadex LH-20柱色谱、中压液相色谱（MPLC）和半制备型HPLC进行分离和纯化。这一过程得到了7种先前未报道的化合物1–7和5种已知化合物8–12（图1）。

化合物1以白色粉末形式分离出来，根据HRESIMS数据其分子式被确定为C₉H₁₃O₂

结论

从D. middletonii Km3279的发酵产物中分离并鉴定了7种先前未报道的化合物1–7以及5种已知化合物。其中，化合物5、8、11和12表现出显著的抗炎作用，而化合物5、7和9表现出明显的抗血管生成作用。特别是，氯化化合物5、7–9和11在抗炎和/或抗血管生成实验中显示出独特的生物活性，凸显了它们的潜力

一般实验程序

光学旋转使用JASCO P-2000数字旋光仪（JASCO，日本东京）进行测量。紫外光谱使用Thermo UV-Visible Heλios α分光光度计（Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）记录。红外光谱使用JASCO FT/IR 4100光谱仪（日本东京）在600/500 MHz和150/125 MHz频率下获得¹H和¹³C的谱线。核磁共振（NMR）谱线分别在Agilent 600/500 MHz DD2 NMR光谱仪（Agilent，美国）上以600/500 MHz和150/125 MHz频率下获得。¹H和¹³C的HRESIMS谱线使用Q Exactive Plus Hybrid仪器测定

CRediT作者贡献声明

王永松：数据管理、概念构思。廖一飞：初稿撰写、正式分析、数据管理、概念构思。程远忠：数据管理。池伟忠：数据管理。刘志毅：数据管理。黄淑贞：数据管理。李宗辉：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、概念构思。王世伟：数据管理。萧乔治：数据管理

未引用参考文献

Chen等人，2022；Chen等人，2022。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC113-2320-B-002-050-MY3）对T.-H.L.的资助。