《Plant Physiology and Biochemistry》：Composition and ultrastructure changes of leaf cuticle wax during the air-curing process in cigars
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本研究针对雪茄烟叶(CTLs)晾制过程中色泽变化机制不清的问题，系统探究了三个品种(DX1、DX3、QX100)烟叶表皮蜡质在晾制期间的动态变化。研究人员通过脂质组学、扫描电镜(SEM)、气相色谱-质谱(GC-MS)等技术，发现蜡质晶体结构坍塌碎裂，神经酰胺(Cer)、己糖基神经酰胺(HexCer)、脂肪酸(FA)含量显著增加，而长链脂肪酸、酯类、甾醇等蜡质成分减少。结果表明表皮蜡质降解与烟叶色泽变化密切相关，为优化烟叶加工工艺提供了新视角。
当一支优质雪茄在指尖缓缓燃烧，其独特的风味和香气背后，是雪茄烟叶经历的精巧而复杂的加工过程。其中，晾制环节尤为关键，它直接决定了烟叶的最终色泽和品质。然而，长期以来，人们对雪茄烟叶在晾制过程中色泽变化的调控机制，特别是最外层的表皮蜡质在这一过程中扮演的角色，知之甚少。表皮蜡质是覆盖在植物叶片最外层的脂质层，如同给叶片穿上了一件“外衣”，它不仅能够减少水分蒸发，帮助植物抵御外界不良环境，还可能与果实和蔬菜的采后品质变化有关。那么，在雪茄烟叶的晾制过程中，这件“外衣”自身会发生怎样的变化？这些变化又与烟叶从翠绿变为黄褐的色泽转变有何关联？这些问题吸引着研究人员去一探究竟。
为了回答这些问题，发表在《Plant Physiology and Biochemistry》上的一项研究，首次系统揭示了雪茄烟叶在晾制过程中表皮蜡质的超微结构、化学组成及其与色泽变化的潜在联系。这项研究不仅增进了我们对烟叶采后生理的理解，也为改进雪茄烟叶的加工工艺提供了重要的理论依据。
研究人员主要运用了几项关键技术来开展这项工作。他们从中国四川什邡的实验田种植的德雪1号(DX1)、德雪3号(DX3)和QX100三个雪茄烟叶品种中，采集了中部叶片作为样本。通过色差仪定量监测了烟叶在晾制0、3、6、12、15、18、24、27天时的颜色参数(L, a, b*)变化。利用冷冻扫描电子显微镜(SEM)观察了烟叶表面蜡质晶体在0、6、15天时的微观形貌。采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析了表皮蜡质的化学成分组成。并通过非靶向脂质组学技术比较了晾制0天和15天时烟叶整体脂质谱的差异。同时，也测定了丙二醛(MDA)含量，并利用透射电子显微镜(TEM)观察了叶绿体超微结构的变化。
3.1. 雪茄烟叶(CTLs)在晾制过程中颜色和结构的变化
研究发现，三个品种的雪茄烟叶在晾制过程中均发生了显著的颜色变化，从采收时的深绿色逐渐变为黄褐色，叶片表面皱缩程度增加。颜色参数显示，亮度(L)和黄蓝色度(b)先升高后降低，而红绿色度(a*)在整个晾制过程中持续增加，特别是在第6天（叶尖和叶缘开始褐变）后增长加快。同时，代表膜脂过氧化程度的丙二醛(MDA)含量持续上升。透射电镜观察发现，晾制15天后，叶绿体的外膜完整性丧失，类囊体堆叠结构解体。这些结果表明，在烟叶颜色发生显著变化的阶段，与脂质相关的生理活动非常活跃。
3.2. 0天和15天CTLs的脂质组学分析
通过对晾制0天和15天的烟叶进行非靶向脂质组学分析，研究人员鉴定出35个脂质亚类和680个脂质分子。主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)均显示0天和15天的样本能明显区分开，说明脂质谱存在显著差异。共筛选出403个差异积累脂质(DALs)，其中神经酰胺(Cer)、己糖基神经酰胺(HexCer)、游离脂肪酸(FA)等10个脂质亚类的含量在15天时显著增加。神经酰胺作为细胞程序性死亡的信号分子，其积累可能促进了烟叶细胞的死亡和色泽变化。脂肪酸含量的增加，特别是C16和C18脂肪酸，提示蜡质代谢在晾制过程中可能被激活。
3.3. 晾制过程中CTL表面蜡层结构的变化
扫描电镜观察显示，在晾制初期(0天)，烟叶表面仅有少量可见的蜡质晶体。随着晾制进行(6天)，蜡质结构开始坍塌，蜡晶数量增多、体积变大。到晾制15天（叶面褐变）时，表面的蜡晶更加丰富和粗大。这表明在烟叶色泽变化的关键时期，表皮蜡质的微观形态发生了显著重塑。
3.4. 晾制过程中CTLs蜡成分的变化
对蜡质化学组成的分析表明，三个品种的变化趋势相似。到晾制15天时，蜡质中的环状化合物（主要是甾醇和生育酚）含量降至0天时的52.86%（DX1）、38.71%（DX3）和40.35%（QX100）。脂肪族化合物（主要是烷烃、脂肪酸和酯）在DX1和DX3中分别下降了27.76%和46.07%，在QX100中则略有增加（2.39%）。总体来看，在色泽变化期，蜡质的总量及其主要组分均呈下降趋势。
3.5. 晾制过程中CTLs主要蜡成分的变化
对具体成分的深入分析发现，在烷烃中，C30和C31烷烃含量最高。C30在DX1和QX100中增加，在DX3中稳定；C31在DX1和DX3中于第6天达到峰值。脂肪酸以C16和C18为主，且在晾制过程中含量下降。酯类也呈现减少趋势。主要的环状成分甾醇（包括胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇等）含量显著降低，而生育酚的变化在不同品种间无一致规律。
综合以上结果，本研究得出结论：在雪茄烟叶的晾制过程中，表皮蜡质发生了显著的降解和转化。微观上，蜡质晶体结构坍塌、碎裂并重新沉积；化学组成上，长链脂肪酸、酯类、甾醇等重要组分含量减少。与此同时，烟叶内部的脂质代谢活跃，神经酰胺、脂肪酸等信号分子和前体物质含量增加。这些变化与烟叶的色泽转变过程在时间上高度吻合。
在讨论部分，研究者将烟叶的色泽变化归因于叶片衰老过程中的细胞程序性死亡和膜脂过氧化。表皮蜡质成分的减少，特别是疏水性的长链脂肪族化合物和甾醇的流失，可能会增加叶片水分的散失速率，从而加速细胞结构的降解和酶促褐变反应的发生。因此，表皮蜡质的变化可能间接地调控了晾制过程中雪茄烟叶的色泽形成。
这项研究首次系统地描绘了雪茄烟叶晾制过程中表皮蜡质的动态变化图谱，将微观形态、化学组成与宏观色泽品质联系起来，揭示了此前被忽视的表皮蜡质在烟叶采后加工中的潜在作用。这不仅为理解雪茄烟叶品质形成机制提供了新的视角，也为未来通过调控蜡质代谢来改善烟叶加工工艺奠定了理论基础。研究者建议，未来的工作应聚焦于蜡质相关基因的表达调控，从而更深入地阐明影响雪茄烟叶晾制品质的关键因素。
