《Plant Stress》：Functional characterization of serotonin
N-acetyltransferases from
Caenorhabditis elegans and enhanced senescence tolerance in transgenic rice overexpressing
CeSNAT1 via melatonin increase
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本研究首次从秀丽隐杆线虫中克隆并功能鉴定了两个古菌SNAT同源基因，发现CeSNAT1具有SNAT酶活性，而CeSNAT2无活性。在转基因水稻中异源过表达CeSNAT1可提高内源褪黑素水平并显著延缓叶片衰老。同时，从寄生虫简单异尖线虫中克隆的AsSNAT显示出更高的催化效率。该研究为从SNAT基因调控角度阐明褪黑素在线虫中的生物学作用奠定了基础。
在生命科学领域，褪黑素（melatonin）作为一种在生物体内广泛存在的分子，扮演着多重生理角色。在动物中，它调控着昼夜节律、季节性繁殖、氧化还原稳态以及睡眠-觉醒周期；在植物中，它则作为一种生物刺激分子，影响着从种子萌发到衰老的众多生物学过程。褪黑素的生物合成始于色氨酸，其关键步骤由血清素N-乙酰转移酶（Serotonin N-acetyltransferase, SNAT）催化。尽管SNAT基因已在脊椎动物、真菌、植物等多种生物中被克隆，但在模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，虽然已观察到其褪黑素水平存在以昼夜为周期的波动，且SNAT酶活性随之变化，但编码SNAT的关键基因却一直未被成功鉴定。这一空白限制了对褪黑素在线虫中生物学功能的深入探索。
为了填补这一知识空白，研究人员在秀丽隐杆线虫基因组中鉴定出两个古菌SNAT同源基因，分别命名为CeSNAT1和CeSNAT2。通过原核表达和蛋白纯化，他们发现纯化的重组CeSNAT1蛋白对血清素和5-甲氧基色胺（5-methoxytryptamine, 5-MT）均表现出SNAT酶活性，其米氏常数（Km）值分别为782 μM和1413 μM。相反，CeSNAT2则未检测到SNAT活性。酶动力学分析表明，CeSNAT1对5-MT的催化效率（Vmax/Km）高于血清素，提示在5-MT水平升高时，CeSNAT1可能优先利用5-MT合成褪黑素。此外，CeSNAT1对酪胺的活性最低，这与某些其他SNAT同源物不同，表明其可能特异性参与褪黑素合成而非广泛的胺类代谢。
为了验证CeSNAT1在体内的功能，研究人员将其在转基因水稻中进行异源过表达。结果显示，过表达CeSNAT1的水稻幼苗内源褪黑素水平显著高于野生型，并且在水培衰老实验中表现出延迟衰老的表型，具体表现为叶片黄化程度减轻、叶绿素含量更高、脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平降低，以及衰老标志基因（Osl2和Osl295）的表达下调。这充分证明CeSNAT1在体内确实能够促进褪黑素合成，并进而增强植物的衰老耐受性。
为了进一步佐证CeSNAT1功能的保守性，研究人员从寄生性线虫简单异尖线虫（Anisakis simplex）中克隆了其SNAT同源基因（AsSNAT）。AsSNAT与CeSNAT1的氨基酸序列一致性为32%。纯化的重组AsSNAT蛋白不仅具有SNAT活性，而且其对血清素和5-MT的Km值（分别为408 μM和188 μM）均低于CeSNAT1，表明其底物亲和力和催化效率更高。这项发表在《Plant Stress》上的研究，首次在分子水平上证实了线虫中存在功能性的SNAT基因，为利用线虫模型深入研究褪黑素的生物学功能，特别是在睡眠、衰老和应激反应等方面的作用，打开了新的局面。
本研究主要采用了以下关键技术方法：1） 基于生物信息学分析筛选候选基因；2） 基因合成与密码子优化；3） 原核表达系统（大肠杆菌）进行重组蛋白表达与镍柱亲和纯化；4） 体外酶动力学分析，测定SNAT酶活性、Km和Vmax值；5） 农杆菌介导的水稻遗传转化获得过表达CeSNAT1的转基因植株；6） 高效液相色谱法检测植物组织中的褪黑素含量；7） 离体叶片衰老实验并结合叶绿素和MDA含量测定以及衰老相关基因的实时荧光定量PCR分析来评估衰老表型。
3.1. Selection and chemical synthesis of CeSNAT1 and CeSNAT2
通过BLASTp分析，在秀丽隐杆线虫基因组中鉴定出两个古菌SNAT同源基因CeSNAT1和CeSNAT2。系统发育分析表明二者均属于古菌TvSNAT分支。研究人员对两个基因进行了全长的化学合成和密码子优化，以提高其在后续水稻表达系统中的效率。
3.2. Purification of recombinant CeSNAT proteins and enzyme kinetic analysis
将合成的CeSNAT1和CeSNAT2基因在大肠杆菌中表达并纯化得到重组蛋白。体外酶活测定证实CeSNAT1具有SNAT酶活性，而CeSNAT2无活性。进一步的酶动力学分析揭示了CeSNAT1对血清素和5-MT的动力学参数，并发现其对多种胺类底物的活性存在差异，其中对5-MT和血清素的活性最高，对酪胺的活性最低。
3.3. Transgenic rice overexpressing CeSNAT1
将CeSNAT1在水稻中异源过表达。转基因水稻幼苗的褪黑素水平显著升高。离体叶片衰老实验表明，过表达CeSNAT1的水稻叶片衰老延迟，表现为叶绿素保留更多、MDA含量更低以及衰老标志基因表达下调。这证明了CeSNAT1在植物体内能够功能性地增强褪黑素合成并提高衰老耐受性。
3.4. Functional characterization of SNAT from A. simplex
从寄生线虫简单异尖线虫中克隆了SNAT同源基因AsSNAT。重组AsSNAT蛋白表现出SNAT酶活性，且其酶动力学参数（更低的Km值和更高的催化效率）表明其催化能力优于CeSNAT1。这进一步支持了SNAT在线虫中功能的保守性，并提示寄生线虫可能具有更强的褪黑素合成能力。
本研究首次成功地从秀丽隐杆线虫中克隆并功能鉴定了其SNAT基因（CeSNAT1），证实其编码具有SNAT酶活性的蛋白，能够催化褪黑素合成途径的关键步骤。通过在水稻中异源过表达CeSNAT1，研究证明了该基因在体内能够有效提高褪黑素水平，并进而赋予转基因植株更强的衰老耐受性，这为利用褪黑素提高作物抗逆性提供了潜在靶点。同时，从简单异尖线虫中克隆的功能性SNAT同源基因（AsSNAT）不仅佐证了CeSNAT1功能的保守性，也揭示了不同线虫物种间SNAT酶学特性的差异。这项研究填补了线虫中褪黑素合成关键基因的空白，为未来在基因水平上深入探索褪黑素在模式生物秀丽隐杆线虫的睡眠、衰老、应激反应等复杂生命过程中的调控机制奠定了坚实的基础，同时也为研究寄生线虫的生物学及开发相关防控策略提供了新的视角。
