《Poultry Science》：Integrative analysis of circRNA, miRNA, and mRNA profiles to reveal ceRNA regulation in geese ovarian development from the birth /laying to ceased periods
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本研究针对评估鹅季节性繁殖效率的关键指标——产蛋性能，以皖西白鹅不同产蛋期（开产期、产蛋期、休产期）卵巢组织为研究对象，通过转录组测序和生物信息学方法构建了circRNA、miRNA和mRNA表达谱。研究揭示了不同时期差异表达的circRNAs，并通过GO和KEGG分析发现其靶基因显著富集于卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及GnRH、MAPK等信号通路。研究成功构建了ceRNA（circRNA-miRNA-mRNA）调控网络，鉴定出四个关键ceRNA调控轴，并利用双荧光素酶报告基因实验验证了novel_circ_072697-miR-143-x-FMN2轴的靶向关系，为阐明鹅卵巢发育的分子机制和提升禽类繁殖性能提供了重要理论依据。
在家禽养殖业中，产蛋性能是衡量禽类繁殖效率和经济价值的关键指标。鹅作为一种具有明显季节性繁殖特征的禽类，其卵巢的发育状态直接决定了产蛋能力。然而，鹅卵巢在不同生理阶段（如开产期、产蛋期和休产期）的分子调控机制，尤其是非编码RNA（non-coding RNA）在其中扮演的角色，尚不十分清楚。深入解析这些分子机制，对于揭示鹅季节性繁殖的生物学特性、提高其产蛋性能具有重要意义。近期，发表在《Poultry Science》上的一项研究，通过对皖西白鹅（Wanxi White Geese, WWGs）不同产蛋期卵巢组织的整合分析，系统描绘了circRNA、miRNA和mRNA的表达图谱，并深入探讨了它们构成的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）调控网络在卵巢发育中的作用。
为了回答上述科学问题，研究人员收集了皖西白鹅在开产期（birth period, BO）、产蛋期（laying period, LO）和休产期（ceased period, CO）的卵巢组织样本。主要关键技术方法包括：利用转录组测序技术（RNA-seq）构建不同时期的circRNA、miRNA和mRNA表达谱；通过生物信息学方法进行差异表达分析、Gene Ontology (GO)功能注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)通路富集分析；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）验证测序结果的可靠性；运用双荧光素酶报告基因实验（Dual Luciferase Reporter Assay）验证关键ceRNA调控轴中分子间的靶向关系。
质量控控制序数据
研究人员对九个卵巢样本进行了高通量测序，经过严格的质量控制，获得了高质量的测序数据。所有样本的Q20值均高于96%，Q30值高于92%，GC含量在48%至52%之间，表明数据质量可靠。对circRNA的特征分析显示，其长度主要集中在300到600个核苷酸（nucleotide, nt）之间，并且80%的circRNA来源于外显子区域。
不同产蛋阶段circRNAs、miRNAs和mRNAs的差异表达分析
通过比较分析，研究发现在BO vs LO比较组中存在504个差异表达的circRNAs（DEcircRNAs），其中上调和下调的circRNA各占一半。在LO vs CO比较组中鉴定出369个DEcircRNAs，而在BO vs CO比较组中则有306个DEcircRNAs。值得注意的是，三个比较组中共同存在的DEcircRNA只有一个（novel_circ_111394）。同样，对miRNA和mRNA的差异表达分析也揭示了不同时期特异的表达模式。例如，BO vs LO比较组中有128个差异表达的miRNAs（DEMs）和4494个差异表达的mRNAs（DEGs）。这些差异表达的分子为后续构建ceRNA网络奠定了基础。
GO功能富集分析
为了解DEcircRNAs的潜在功能，研究人员对其靶基因进行了GO富集分析。结果显示，在BO vs LO比较中，靶基因显著富集于479个GO条目，主要涉及细胞粘附、GTP酶结合、离子聚集和蛋白酪氨酸激酶活性等生物过程。在LO vs CO和BO vs CO的比较中，也分别发现了608个和900个显著富集的GO条目，这些过程与GTP酶激活活性、细胞间粘附连接以及钙离子跨膜转运活性等相关，暗示了DEcircRNAs可能通过调控这些关键生物学过程来影响鹅卵巢的发育和功能。
KEGG富集分析
KEGG通路富集分析进一步揭示了DEcircRNAs靶基因参与的关键信号通路。在BO vs LO比较中，显著富集的通路包括内吞作用、GnRH（促性腺激素释放激素）信号通路和MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路。LO vs CO比较组中的靶基因则显著富集于细胞衰老、MAPK信号通路、p53信号通路和细胞粘附分子（CAMs）通路。BO vs CO比较组则显示出与粘附连接、磷酸肌醇代谢和孕酮介导的卵母细胞成熟等通路相关的富集。这些通路与卵巢颗粒细胞增殖、凋亡、分化以及卵泡发生密切相关，提示DEcircRNAs可能通过这些通路调控鹅的卵巢发育和产蛋性能。
实时荧光定量逆转录PCR验证
为了验证转录组测序结果的可靠性，研究人员随机选取了部分DEGs、DEMs和DEcircRNAs进行qRT-PCR验证。结果表明，这些分子的相对表达趋势与RNA-seq数据一致，证实了测序结果的真实性和可靠性。
蛋白质印迹法检测蛋白
在蛋白质水平上，研究人员通过Western blot技术检测了CD44、CPEB1、ZAR1等蛋白在不同产蛋期卵巢组织中的表达。结果显示，某些蛋白（如CPEB1、ZAR1）的表达在不同时期存在显著差异，这与转录组水平的发现相呼应，进一步从蛋白质层面支持了转录组数据的结论。
构建circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络
研究的核心成果之一是构建了ceRNA调控网络。通过整合DEMs、DEcircRNAs和DEGs，并基于分子间表达水平的负相关和正相关关系，研究人员成功构建了三个比较组（BO vs LO, LO vs CO, BO vs CO）的ceRNA网络。例如，BO vs LO网络包含54个节点和100条边，涉及18个DEcircRNAs、9个DEMs和27个DEGs。对这些网络中mRNA靶基因的KEGG分析显示，它们显著富集于细胞外基质-受体相互作用、粘着斑、TGF-β（转化生长因子-β）信号通路、GnRH分泌以及醛固酮合成与分泌等与生殖密切相关的通路。
双荧光素酶报告基因检测
为了验证ceRNA网络中的关键调控关系，研究人员选取了novel_circ_072697-miR-143-x-FMN2这一调控轴进行双荧光素酶报告基因实验。实验结果证实，novel_circ_072697和FMN2的3‘非翻译区（3’UTR）上均存在与miR-143-x结合的位点，当共转染miR-143-x模拟物（mimic）和含有野生型结合位点的报告基因载体时，荧光素酶活性显著降低，而突变结合位点后则活性恢复。这直接证明了novel_circ_072697可以作为miR-143-x的“分子海绵”，从而解除其对靶基因FMN2的抑制作用，即存在ceRNA调控机制。
综合研究结果与讨论，本研究系统性地揭示了circRNAs在鹅卵巢发育不同阶段的动态表达谱及其潜在的ceRNA调控机制。研究不仅鉴定出大量与产蛋期相关的DEcircRNAs、DEMs和DEGs，还通过功能富集分析发现这些分子参与调控诸如GnRH信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路以及孕酮介导的卵母细胞成熟等关键生殖相关通路。更重要的是，研究成功构建了ceRNA调控网络，并筛选出四个关键的ceRNA调控轴：novel_circ_107999-miR-144-y-NR2F2/TGM2、novel_circ_072697-miR-143-x-FMN2、novel_circ_031722-miR-101-x-CASP2/RPN2以及novel_circ_100886-miR-101-y-PTX3/SEMA3E/HSD3B1。这些调控轴中的基因（如FMN2、NR2F2、CASP2、HSD3B1等）已被前人研究证实与颗粒细胞功能、激素合成、卵泡发育等过程密切相关。本研究通过实验验证了novel_circ_072697-miR-143-x-FMN2轴的靶向关系，为ceRNA假说提供了实验证据。
综上所述，这项研究首次在鹅模型中系统阐述了从开产到休产期卵巢组织的ceRNA调控网络，深化了对禽类季节性繁殖分子基础的理解。所发现的关键circRNAs和ceRNA调控轴为未来通过分子育种手段改善鹅的繁殖性能提供了潜在的靶点，具有重要的理论意义和应用前景。该研究成果由J.H. Fan、X.J. Li、S.H. Li等作者完成，并发表于《Poultry Science》。
