LNK-CBL-HNRNPA2B1-GPX4信号轴介导帕金森病多巴胺能神经元铁死亡新机制

《Redox Biology》：A LNK–CBL–HNRPA2B1–GPX4 Signaling Axis Mediates Dopaminergic Neuron Vulnerability to Ferroptosis in Parkinson's disease

本研究揭示了LNK-CBL-HNRNPA2B1-GPX4信号轴在帕金森病多巴胺能神经元铁死亡中的关键作用。研究人员通过体内外实验证实，LNK通过促进CBL介导的HNRNPA2B1 K27连接多聚泛素化降解，降低GPX4 mRNA稳定性，从而加剧神经元铁死亡。研究发现FDA批准药物利非斯特可靶向LNK SH2结构域，有效缓解MPTP诱导的帕金森病模型神经退行性变，为帕金森病治疗提供了新靶点。

　　

帕金森病作为全球第二常见的神经退行性疾病，其主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的进行性丧失。虽然铁死亡（一种铁依赖性的调节性细胞死亡方式）被认为在帕金森病发病中起关键作用，但其上游调控机制仍不明确。多巴胺能神经元因其高铁含量和多巴胺代谢的促氧化特性，对铁死亡尤为敏感。探索调控多巴胺能神经元铁死亡易感性的关键分子通路，对于开发新的治疗策略具有重要意义。

近期发表在《Redox Biology》上的一项研究，深入探讨了这一问题。该研究团队发现，淋巴细胞衔接蛋白（LNK）在帕金森病患者外周血中表达显著上调，且与运动障碍严重程度呈正相关。在帕金森病小鼠模型中，也观察到类似的LNK上调现象。为了阐明LNK在帕金森病中的具体作用，研究人员综合运用了基因敲除小鼠模型、细胞生物学、分子生物学、蛋白质组学、代谢组学等多种技术手段。研究队列包括帕金森病患者外周血样本、MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）诱导的帕金森病小鼠模型、以及SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系和原代神经元等体外模型。关键技术涉及行为学测试、免疫组织化学/荧光、免疫印迹、免疫共沉淀、GST Pull-down、生物层干涉技术、微量热泳动、RNA免疫共沉淀、m⁶A甲基化RNA免疫共沉淀、细胞热转移分析、分子对接虚拟筛选、透射电子显微镜、液相色谱-质谱联用蛋白质组学和代谢组学分析等。

3.1. LNK缺陷减轻MPTP诱导的神经病理变化

研究人员首先确认LNK在帕金森病中的相关性。分析公共数据库和患者样本发现，帕金森病患者外周血和黑质中LNK表达升高。在MPTP处理的小鼠中，黑质和纹状体的LNK mRNA和蛋白水平也显著增加。通过构建全身性LNK敲除（Lnk^-/-）小鼠，研究发现LNK缺失能显著改善MPTP引起的小鼠运动功能障碍，包括在旷场试验中增加运动总距离和平均速度，在旋转棒试验中延长跌落潜伏期，在杆试验中缩短下落时间。更重要的是，LNK缺失有效减轻了MPTP导致的黑质致密部酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元丢失和纹状体TH阳性纤维密度降低，表明LNK缺陷对多巴胺能神经元具有保护作用。代谢组学分析进一步显示，LNK缺失改变了纹状体的神经化学景观，提升了多巴胺通路相关代谢物水平。

3.2. LNK以多巴胺神经元自主的方式驱动神经退行性变

为了确定LNK在哪种细胞中发挥作用，研究人员检测了其在帕金森病模型中的细胞分布。发现LNK在小胶质细胞、星形胶质细胞和多巴胺神经元中均有表达，但在多巴胺神经元中的诱导最为显著。为了明确多巴胺神经元自身来源的LNK是否足以介导神经退行性变，研究人员构建了多巴胺神经元特异性LNK条件性敲除小鼠（LNK^ΔDat）。结果显示，特异性敲除多巴胺神经元中的LNK，足以模拟全身性敲除的保护效应，显著减轻了MPTP引起的运动缺陷和多巴胺能神经元的丢失。这些结果证明LNK在多巴胺神经元中自主地促进其退化。

3.3. LNK缺陷选择性上调关键抗铁死亡调节因子GPX4

机制探索方面，代谢组学分析提示LNK缺失主要影响脂质代谢通路。已知脂质代谢紊乱和脂质过氧化是铁死亡的核心环节。靶向氧化脂质组学分析证实，LNK缺失减少了MPP⁺处理的原代神经元中氧化的多不饱和脂肪酸磷脂的积累。转录组和功能富集分析均显著富集到铁死亡通路。在22个高频候选基因中，GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）——铁死亡的关键负调控因子——在LNK缺失的神经元中mRNA和蛋白水平均显著上调。在体实验也证实，多巴胺神经元特异性敲除LNK能上调GPX4蛋白水平，提高还原型/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比率，降低丙二醛（MDA，脂质过氧化产物）水平，并改善线粒体超微结构。这些结果表明LNK缺陷通过上调GPX4来抵抗铁死亡。

3.4. LNK通过负调控GPX4促进帕金森病细胞模型中的铁死亡

在SH-SY5Y细胞中敲低LNK，能减轻MPP⁺诱导的细胞死亡，改善GSH/GSSG比率，降低MDA、脂质活性氧和总活性氧水平，并上调GPX4蛋白。相反，过表达LNK则加剧了MPP⁺的毒性作用，并进一步下调GPX4。使用铁死亡诱导剂RSL3或FIN56可逆转LNK敲低带来的保护作用，而铁死亡抑制剂Liproxstatin-1或Ferrostatin-1则可缓解LNK过表达加剧的损伤。这证明LNK通过负调控GPX4来促进铁死亡。

3.5. LNK通过m⁶A–HNRPA2B1依赖的机制在转录后水平抑制GPX4表达

进一步探索LNK调控GPX4的机制，发现LNK不影响GPX4蛋白的降解速率，但显著缩短了GPX4 mRNA的半衰期，表明LNK在转录后水平负调控GPX4。通过免疫共沉淀联合质谱分析，研究人员发现LNK与RNA结合蛋白异质核核糖核蛋白A2/B1（HNRNPA2B1）存在相互作用。LNK能负调控HNRNPA2B1的蛋白稳定性，促进其通过泛素-蛋白酶体途径降解。HNRNPA2B1是m⁶A（N6-甲基腺嘌呤）阅读器，能识别m⁶A修饰的转录本并增强其稳定性。研究证实GPX4mRNA的3‘非翻译区存在m⁶A修饰位点，且HNRNPA2B1能结合该m⁶A修饰的GPX4mRNA。LNK敲低增强了HNRNPA2B1与GPX4mRNA的结合，稳定了GPX4mRNA；而LNK过表达则起相反作用。敲低m⁶A甲基转移酶METTL3会减少HNRNPA2B1与GPX4mRNA的结合，证明m⁶A修饰是必要的。

3.6. LNK依赖性铁死亡调控需要HNRNPA2B1

功能挽救实验表明，同时敲低LNK和HNRNPA2B1，会逆转单独敲低LNK所带来的GPX4上调、细胞存活率提高以及氧化应激指标改善等保护效应。相反，在LNK过表达的细胞中，共同过表达HNRNPA2B1能部分挽救其表型。这证明HNRNPA2B1是LNK调控铁死亡通路中不可或缺的下游效应分子。

3.7. LNK通过K27连接的多聚泛素化介导HNRNPA2B1的蛋白酶体降解

研究发现LNK通过促进HNRNPA2B1的泛素化降解来调控其蛋白水平。蛋白酶体抑制剂而非溶酶体抑制剂能逆转LNK过表达导致的HNRNPA2B1降低。泛素化实验表明，LNK主要促进HNRNPA2B1的K27连接的多聚泛素化，并鉴定出K100、K156和K161是关键的泛素化位点。

3.8. LNK招募E3泛素连接酶CBL介导HNRNPA2B1的K27连接多聚泛素化

由于LNK是衔接蛋白，本身不具有E3连接酶活性，研究人员寻找其合作的E3连接酶。发现LNK与E3泛素连接酶Casitas B系淋巴瘤原癌基因（CBL）相互作用，并能将CBL招募至HNRNPA2B1。分子对接和实验证实CBL与HNRNPA2B1直接结合，且结合依赖于CBL第731位酪氨酸（Tyr731）的磷酸化。磷酸化的CBL能发生核转位，在细胞核内对HNRNPA2B1进行K27连接的多聚泛素化修饰，导致其降解。LNK正是通过促进CBL的Tyr731磷酸化及后续核转位，来驱动这条信号轴。

3.9. 利非斯特直接结合并抑制LNK以改善MPP⁺/MPTP诱导的多巴胺能神经退行性变和铁死亡

最后，研究探索了靶向LNK的治疗潜力。通过基于结构的虚拟筛选，研究人员从已批准药物库中筛选出利非斯特（Lifitegrast，一种LFA-1拮抗剂），预测其可与LNK的SH2结构域结合。实验证实利非斯特能直接结合LNK蛋白，并在细胞中稳定LNK。在细胞模型中，利非斯特处理能破坏LNK-CBL相互作用，抑制HNRNPA2B1的泛素化，上调GPX4，并保护细胞免受MPP⁺诱导的铁死亡。在MPTP小鼠模型中，通过微型渗透泵持续给予利非斯特，能显著改善小鼠的运动功能，减轻黑质多巴胺能神经元的丢失，降低氧化应激指标，并维持GPX4蛋白水平。

综上所述，该研究揭示了一条全新的LNK–CBL–HNRNPA2B1–GPX4信号轴，该轴通过调控m⁶A介导的GPX4mRNA稳定性，在帕金森病多巴胺能神经元铁死亡中发挥核心作用。研究不仅深化了对帕金森病中铁死亡调控机制的理解，还将LNK确立为一个有潜力的治疗靶点。此外，研究发现已上市药物利非斯特可作为LNK的抑制剂，为帕金森病的药物重定位治疗提供了新的思路和实验依据，具有重要的理论意义和潜在的转化价值。