通过集成的CRISPR-FTIR表型组学平台，解析益生菌E. coli Nissle 1917中赖氨酸脱羧酶的功能冗余性

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Deciphering functional redundancy of lysine decarboxylases in probiotic E. coli Nissle 1917 via an integrated CRISPR-FTIR phenomics platform

本研究利用同步辐射傅里叶变换红外显微光谱结合CRISPR-Cas9基因编辑技术，解析了益生菌大肠杆菌Nissle 1917中ldcC1和ldcC2功能冗余。发现ΔldcC1突变体出现膜重构特征，双突变体（ΔldcC1ΔldcC2）在代谢脆弱性方面具有基础性升高，证实ldcC2是关键功能互补基因，而ldcC1主要维持膜稳态，揭示了代谢冗余对细胞内在稳健性的重要性。

　　

张一青|吴明宇|耿峰|王亚迪|吕俊宏

滨州医学院药学院，中国烟台264003

摘要

傅里叶变换红外（FTIR）微光谱是一种快速、无标记的微生物代谢表型分析工具。在本研究中，我们将基于同步辐射的FTIR微光谱技术与CRISPR-Cas9编辑技术相结合，以解析益生菌大肠杆菌 Nissle 1917中赖氨酸脱羧酶（LdcC1和LdcC2）的功能冗余性。在赖氨酸胁迫条件下，同源突变体（ΔldcC1、ΔldcC1ΔldcC2）表现出不同的FTIR特征。光谱分析显示：(i) CH峰的移动（2950–2850?cm^?1），表明ΔldcC1具有特定的膜重塑作用；(ii)酰胺I带轮廓的变化（约1650?cm^?1），暗示蛋白质结构发生了扰动；(iii) 双突变体在1220–1260?cm^?1区域的吸收强度持续升高，揭示了其代谢系统的脆弱性。通过对二阶导数光谱进行主成分分析，我们发现不同菌株之间存在明显的表型差异。研究表明LdcC2是关键的功能补充因子，而LdcC1则主要参与维持膜稳态。双突变体中激活的补偿性应激反应进一步证实了代谢冗余性是细胞内在稳定性的基础。总体而言，这项工作验证了一个将靶向遗传学与全局生物化学相结合的CRISPR-FTIR表型分析平台，为微生物的功能基因组学和代谢工程提供了快速的方法。

引言

了解益生菌的代谢网络对于优化其治疗效果至关重要[1]、[2]。一个典型的例子是大肠杆菌 Nissle 1917（EcN）中的代谢冗余性，其中同源酶系统（如ldcC1/ldcC2）在酸耐受性和肠道定植中发挥作用[3]、[4]。虽然这种冗余性对细菌生存具有进化优势，但它给确定单个酶的贡献及益生菌工程带来了挑战[5]。传统的生长测定和批量代谢组学方法无法区分这些同源酶的个体作用[6]、[7]，也无法快速分析由此产生的表型变化[8]。因此，迫切需要能够提供快速、高分辨率和全面生化表型分析的分析技术[9]。

傅里叶变换红外（FTIR）光谱是一种广泛用于微生物分析的方法，能够快速、无标记地获取全局生化谱型[10]、[11]。FTIR微光谱技术将FTIR光谱仪与显微镜结合使用，实现了显著的空间分辨率提升，可以分析单个细胞或微菌落，减少培养基的背景干扰，并便于研究群体异质性。在细菌学研究中，FTIR微光谱已被应用于菌株鉴定、抗生素作用机制分析、生物膜基质成分分析以及微菌落内代谢变化的研究[12]、[13]、[14]。FTIR对分子振动的敏感性使其特别适合检测蛋白质二级结构的变化（主要通过酰胺I带（1700–1600?cm^?1））和膜动态（通过CH伸缩区域（3000–2800?cm^?1）[15]、[16]、[17]、[18]、[19]）。这些发现通常优于色谱方法在检测应激诱导的修饰方面的能力[10]、[11]。此外，FTIR的非破坏性特性结合多元分析方法，支持了对微生物系统的高通量筛选[20]。基于同步辐射的FTIR微光谱技术的出现进一步提升了空间分辨率和信噪比，使得对活细菌进行高灵敏度的光谱分析成为可能[21]。

在本研究中，我们利用基于同步辐射的FTIR微光谱的高分辨率能力，探究了EcN中ldcC1/ldcC2脱羧酶系统的功能分工。我们将精确的CRISPR-Cas9基因编辑技术与FTIR表型分析相结合，构建并分析了同源突变体。我们的目标有两个：首先，阐明在赖氨酸胁迫条件下这些冗余基因缺失所导致的特定代谢和结构变化；其次，验证FTIR作为解码复杂基因型-表型关系的主要工具的有效性。这项工作不仅阐明了这种关键益生菌的酸耐受性生物学机制，还验证了一个可用于合理设计工程微生物菌株的可扩展光谱平台。

菌株、质粒和生长条件

本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表S1中。克隆使用的是大肠杆菌 DH5α。基因组编辑使用的是野生型大肠杆菌 Nissle 1917。所采用的质粒系统包括：pREDCas9（用于持续表达Cas9）和pGRB（用于表达gRNA）。菌株在LB培养基（10?g/L蛋白胨、5?g/L酵母提取物、10?g/L NaCl）中以37?°C或30?°C、200?r/min的速度培养。固体培养基中添加了20?g/L琼脂。根据需要添加抗生素：氨苄西林（100?μg/mL）。

用于代谢基因评估的集成CRISPR-FTIR策略

我们开发了一种结合CRISPR-Cas9基因编辑与FTIR光谱的技术，以解析EcN中冗余的ldcC同源基因（ldcC1和ldcC2）的功能作用（图1）。LdcC催化l-赖氨酸转化为尸胺和CO?，这对酸耐受性至关重要。通过测序和表型筛选构建并验证了同源突变体（WT、KO1?=?ΔldcC1、KO2?=?ΔldcC1ΔldcC2）。

结论

本研究明确证明了基于同步辐射的FTIR微光谱技术在微生物代谢表型分析中的强大作用。通过将其与CRISPR-Cas9基因编辑技术结合，我们解析了益生菌大肠杆菌 Nissle 1917中ldcC1/ldcC2赖氨酸脱羧酶同源基因的功能冗余性。CRISPR-Cas9技术实现了精确的同源突变体（ΔldcC1和ΔldcC1ΔldcC2）的构建，高分辨率的同步辐射技术也为此提供了支持。

资助

本研究部分得到了国家自然科学基金（NSAF）联合基金（U2230110）、济南微生态生物医学实验室研究项目（JNL-2025013C）以及上海国际科技合作计划（22490714400）的财政支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢上海国家蛋白质科学设施（NFPS）的BL01B光束线和上海同步辐射设施的BL06B光束线在数据收集过程中提供的帮助。