创新的室内水培共培养技术：通过光调控优化生菜的生长以及具有营养价值和生物柴油潜力的微藻（Chlorella sp. G049）的生物量

《Algal Research》：Innovative indoor hydroponic co-cultivation: Light-driven optimization of lettuce growth and microalgal Chlorella sp. G049 biomass with nutritional and biodiesel potentials

本研究通过重离子束诱变获得一株高异养生长率（+25%）和虾青素产量（+86.17%）的微藻突变体JWHIB 27–38，其脂质含量（+69.61%）亦显著提高。组学分析揭示该突变体通过调控叶绿素合成蛋白（如CPOX）、脂肪酸代谢关键酶及虾青素合成相关蛋白（如Phytoene Synthase、AstaP）的表达实现高效产色。

　　

Kyarii Ramarui|Jie Wang|Gary H. Wikfors|Yantao Li

马里兰大学海洋与环境技术研究所、马里兰大学环境科学中心及马里兰大学巴尔的摩县分校，701 E Pratt Street, 巴尔的摩, MD, 21202, 美国

摘要

Haematococcus pluvialis 是天然虾青素的生产者，但由于其生物量产量低且虾青素生成效率不高，因此用于工业生产的尝试受到限制。通过菌株工程来改善其生长和虾青素产量受到对该微藻虾青素生物合成机制理解不足的制约。本研究旨在通过培育一种生长和虾青素产量均得到提升的 Haematococcus 突变体，并探讨该藻类在从异养状态向高光照压力条件转变过程中的应激反应，以克服这些限制。我们采用物理辐射诱变方法培育出在异养条件下具有更高细胞分裂率的 Haematococcus 突变体。其中 JWHIB 27–38 突变体在异养条件下的生长速率比野生型高出 25%。在高光照压力下，JWHIB 27–38 突变体的脂质含量比野生型高 69.61%，每细胞虾青素含量高 86.17%。通过对 JWHIB 27–38 突变体和野生型进行比较蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析，发现该突变体在高光照压力下仍保持较高的叶绿素生物合成相关蛋白及磷酸蛋白（包括原卟啉原氧化酶）的表达水平。此外，突变体中脂肪酸生物合成相关蛋白（如生物素羧基载体蛋白）的表达上调，表明固定碳被重新定向用于脂质合成。关键虾青素生物合成蛋白 phytoene synthase 以及一种推测参与虾青素转运的蛋白 AstaP 的表达上调可能有助于突变体中虾青素的积累和转运。这些及其他差异表达的蛋白为未来通过菌株工程提高微藻虾青素产量提供了有希望的目标。

引言

虾青素是一种脂溶性抗氧化剂，具有鲜艳的红色，其抗氧化活性是维生素 E 的 100 倍 [1]，[2]。这些特性使其在制药、营养保健品、化妆品、水产养殖和农业等多个领域具有很高的价值 [3]。预计到 2027 年，全球虾青素市场规模将达到 34 亿美元 [4]，这推动了对可再生虾青素来源的需求。Haematococcus pluvialis（绿藻门，Volvocales 目）是一种淡水绿藻，因其能按重量产生 4–7% 的虾青素而受到工业界的关注 [5]，[6]，是自然界中最高的虾青素生产者。然而，由于生长速度慢和生物量产量低，H. pluvialis 的工业化培养仍受到限制，从而导致其生物量和虾青素产量较低 [7]。

在 H. pluvialis 的生命周期中，生物量积累与虾青素生成是相互排斥的，因为虾青素主要在细胞生长停止的应激条件下产生 [3]。因此，H. pluvialis 通常采用两阶段培养技术：在“绿色阶段”提供富含营养的培养基和最佳生长条件，以促进光生物反应器或发酵罐中的营养生长 [7]，[8]。这可以通过异养模式实现，在该模式下，培养物在无光条件下获得外源碳源 [3]，[9]。异养生长对工业化培养具有多种优势，包括高密度培养 [9]、营养物质的精确控制、更好的污染防护 [3]、[11]、[12]，以及更高的产品（如欧米伽-3 脂酸或类胡萝卜素）产量，从而降低了收获和产品分离的成本 [9]。当生物量浓度达到最大值时，培养物进入“红色阶段”，此时绿色营养细胞会经历光氧化（高光照）压力，转化为红色无鞭毛孢子（囊状结构）[3]。除了高光照压力外，Haematococcus 细胞暴露于活性氧（ROS）诱导物质、营养匮乏、盐度变化等环境也会促进虾青素的积累。高光照压力常被选为诱导 H. pluvialis 虾青素生成的主要因素 [3]，[13]。

异养阶段后，Haematococcus 细胞的生理状态可能影响其在红色阶段的虾青素积累潜力。例如，异养阶段提供的乙酸可以被代谢为乙酰辅酶 A（acetyl-CoA），这是多种代谢途径（包括脂肪酸生物合成）的关键前体 [14]。在应激条件下，脂肪酸生物合成与虾青素积累呈正相关 [15]，并且大约 95% 的 Haematococcus 虾青素以脂肪酸单酯或双酯的形式存在，这可能有助于提高虾青素在脂质体内的溶解度 [16]。因此，增强的脂质生物合成能力可能使细胞能够积累更多的虾青素。

以往针对 H. pluvialis 较慢异养生长速度的研究主要集中在优化培养基和培养条件上，但效果有限 [17]，[18]，[19]。随着微藻遗传工程工具的快速发展以及基因组测序成本的降低，直接通过菌株工程针对特定代谢途径进行改造成为几种模式微藻的可行策略 [18]，[20]。然而，由于对其基因组和遗传工具的了解有限，H. pluvialis 的靶向菌株工程仍具有挑战性；目前大多数改进工作采用随机诱变后筛选理想表型的方法 [3]，[18]，[21]。蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析使得在不同实验条件下蛋白质和磷酸蛋白质的全面表征成为可能 [22]，[23]，这为识别可能负责理想表型的蛋白质或磷酸蛋白质提供了依据，从而为未来的菌株工程提供了目标。

在本研究中，我们分析了通过重离子束诱变获得的 Haematococcus 突变体 JWHIB 27–38（简称突变体 J）的生长表现以及其蛋白质和磷酸蛋白质的表达差异。该突变体在异养条件下始终比野生型具有更高的细胞密度。在高光照压力下，突变体 J 的细胞密度低于野生型，但细胞体积更大，生物量更高，每细胞虾青素含量也更高。我们在高光照压力作用 0、48 和 72 小时时进行了蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析以验证表型结果。本研究揭示了异养阶段细胞的生理状态如何影响向高光照压力过渡时的中心碳代谢、脂质生物合成和虾青素生物合成，并确定了未来合理工程改造以提高虾青素产量的潜在目标。

菌株和培养条件

野生型 Haematococcus pluvialis NIES 144 来自日本国立环境研究所微生物培养收集库（NIES），并在 C 培养基中维持。C 培养基的营养成分如下 [24]：0.96?g?L^?1 CH₃COONa, 0.15?g?L^?1 Ca(NO₃)·4H₂O, 0.10?g?L^?1 KNO₃, 0.05?g?L^?1 β-甘油磷酸二钠盐水合物, 0.04?g?L^?1 MgSO₄·7H₂O, 0.50?g?L^?1 C₄H₁₁NO₃ (Tris base), 1?mg?L^?1 Na₂ETDA•2H₂O, 0.196?mg?L^?1 FeCl₃•6H₂O, 0.36?mg?L^?1 MnCl₂•4H₂O, 0.22?mg?L^?1

突变体 J 的生物量、叶绿素、脂质和每细胞虾青素含量更高

突变体 J 是通过重离子束诱变产生的，从 1546 个候选菌株中通过检测 750?nm 处的光学密度和细胞密度来筛选出具有增强异养生长能力的菌株。选择异养生长能力增强作为筛选标准，以解决 Haematococcus 生产中异养生长速度慢的问题 [8]。在实验室规模的两阶段培养实验中，突变体 J 在多个表型特征上与野生型存在显著差异

结论

我们分离出一种虾青素含量更高的 H. pluvialis 突变体，并通过蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析进一步研究了其表型特征。突变体 J 中叶绿素含量的增加可能是由于关键叶绿素生物合成蛋白（如 CPOX 和镁螯合酶）的表达上调。在高光照压力下，突变体 J 将碳分配途径从糖异生、淀粉积累和 TCA 循环转向了其他途径。同时，脂肪酸生物合成相关蛋白的表达也得到上调

数据和材料的可用性

质谱蛋白质组学数据已通过 PRIDE 合作伙伴存储库上传至 ProteomeXchange 联盟，数据集标识符为 PXD060374。本研究中使用的生物信息学工具均为免费或提供免费版本。

CRediT 作者贡献声明

Kyarii Ramarui：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。Jie Wang：审稿与编辑、数据分析、概念构建。Gary H. Wikfors：审稿与编辑、项目监督、概念构建。Yantao Li：审稿与编辑、项目监督、资源协调、资金获取、方法设计。

代码可用性

不适用。

资助

本研究得到了美国国家海洋和大气管理局教育合作项目（NA16SEC4810007）、马里兰工业合作伙伴计划（MIPS）项目编号 6510、7405 和 7602 的资助，以及马里兰大学海洋与环境技术研究所（IMET）天使投资者计划的部分支持。

未引用参考文献

[70]

利益冲突声明

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益和个人关系：李彦涛博士报告称获得了美国国家海洋和大气管理局教育合作项目的财务支持；李彦涛博士还报告获得了马里兰工业合作伙伴计划的财务支持。如果还有其他作者，他们声明自己没有已知的财务利益或个人关系

致谢

我们感谢 Lisa Guy、Katyanne Shoemaker 博士、Mark Dixon 和 Diane Kapareiko（美国国家海洋和大气管理局渔业服务局东北渔业科学中心）在实验准备、实验设置和实施过程中提供的帮助。