用于野生型和突变型BRAF蛋白质谱分析的快速微流控样品制备方法

《Analytica Chimica Acta》：Rapid microfluidic sample preparation for mass spectrometric analysis of wild-type and mutant BRAF protein

微流控芯片整合免疫沉淀、多步洗涤和芯片上蛋白消化，将BRAF V600E检测时间从12小时缩短至3小时，提升质谱分析效率及临床应用潜力。

　　

林彦恒|张恒云|吴佳春|萧永进|文英豪|余肇松

台湾桃园市长庚大学生物医学工程系

摘要

背景

BRAF V600E突变蛋白是诊断和预测结直肠癌的重要生物标志物。通过质谱（MS）进行定量检测需要从复杂的细胞提取物中纯化蛋白质，并将其消化成替代肽，这一过程传统上至少需要约12小时，既耗时又费力，从而限制了其在临床中的应用。

结果

我们开发了一种自动化的微流控样品制备芯片，该芯片集成了免疫沉淀、多步骤洗涤和珠子上胰蛋白酶消化功能，通过使用气动驱动的微混合器、微阀门和磁导珠来实现这些过程。珠子上消化技术消除了多次缓冲液更换的步骤，简化了流体控制，并且比传统的洗脱-消化工作流程产生了更多的BRAF肽（传统流程中仅能回收约50%的捕获蛋白质）。从澄清的细胞裂解物开始，该设备可在大约2.5至3小时内生成肽样品。

意义与创新

尽管之前已有报道过该工作流程的各个组成部分，但本平台实现了免疫-质谱样品制备的端到端集成和自动化。这项工作强调了操作的简便性和快速周转时间，为基于质谱的突变蛋白分析在转化医学和精准医疗应用中提供了实用的解决方案。

引言

根据世界卫生组织的数据，恶性肿瘤约占所有死亡人数的10%，是全球十大死因之一[1]。早期发现和及时干预是提高癌症生存率的有效策略。临床实践中采用的不同策略包括疾病预防、诊断和预后[2]。现有的诊断工具分为基于成像的方法[3]和基于流体的检测方法[5][6]。现代成像技术（如内窥镜检查、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）的空间分辨率不断提高；然而，这些技术通常只能在肿瘤形成后可识别出其存在。此时，疾病已经进入晚期，治疗难度较大。

基于流体的检测技术，即“液体活检”，可以在疾病早期阶段揭示与肿瘤相关的分子变化，因为这些变化通常先于明显的解剖学异常出现。液体活检方法通常关注基因组或蛋白质组生物标志物。基于DNA和RNA的检测方法可以检测特征性的基因突变或表达模式；例如，BRAF基因的突变与多种致命或对治疗敏感的肿瘤密切相关，包括结直肠癌[7]、黑色素瘤[8]和乳头状甲状腺癌[9]。传统的基因分型工作流程通常从肿瘤DNA提取开始，然后使用限制性片段长度多态性（RFLP）或单链构象多态性（SSCP）技术进行突变分析。

蛋白质生物标志物可能能更准确地反映病理生理状态，因为并非所有突变基因都会表达出来。因此，人们开始关注将突变蛋白作为癌症特异性生物标志物[10][11]。Milicevic等人使用免疫组化（IHC）来可视化乳腺肿瘤中的突变p53；然而，IHC本质上是定性的，无法提供准确的定量结果[12]。原则上，可以通过针对新表位的抗体来识别突变BRAF蛋白，但基于突变BRAF抗体的富集效率较低[10]，限制了其实际应用。免疫-质谱（immuno-MS）是一种强大的定量替代方法。首先通过免疫沉淀（IP）富集目标蛋白，然后用胰蛋白酶进行消化。随后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析一个或多个生物信息学选择的替代肽。通过添加一个稳定同位素标记的标准肽（SIS）来进行定量，该标准肽与替代肽具有相同的序列，但含有重同位素。内源性肽与其SIS对应物的强度或面积比即可得出蛋白质浓度[13]。Kuzyk等人利用这种方法对人血浆中的45种蛋白质进行了定量[14]。我们的团队采用了相同的原则，使用不同的替代肽/SIS肽对来同时定量野生型（BRAF V600）和突变型（BRAF V600E），从而为癌症筛查提供了可操作的信息。然而，尽管分析能力强，但蛋白质分析的样品制备过程仍然耗时。在结直肠癌细胞裂解物中定量BRAF蛋白需要从IP到酶消化大约12小时，随后的LC-MS/MS分析耗时约65分钟。这些时间限制了分析通量。我们提出了一种微流控芯片，将免疫沉淀、洗涤和快速芯片内消化集成到一个自动化的工作流程中。

微流控技术具有快速反应动力学、试剂消耗少和自动化程度高的优点。高表面积结构（如微柱阵列）通过增加抗原-抗体相互作用的概率来加速IP过程[16][17]；然而，它们通常需要外部泵来驱动流体流动。数字微流控技术与磁珠方法的结合虽然易于集成且用途广泛，但通常受限于较小的反应体积和有限的流体混合效率[18][19][20]。聚二甲基硅氧烷（PDMS）软光刻技术使得气动微阀门和微混合器的集成成为可能，从而实现了完全自动化的芯片上染色质免疫沉淀[21][22][23]。我们采用了这一概念来进行蛋白质样品制备。将胰蛋白酶固定在三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）单体芯片上，比直接表面固定能提供更高的酶负载，从而实现快速蛋白水解[24][25]。然而，芯片内单体的制备相对耗时。纳米级表面图案化提供了另一种高密度胰蛋白酶附着的方法[26]，但固定酶的反应效率通常低于自由溶液消化。大多数微流控平台仅关注独立的步骤（如免疫捕获或单独的消化），仍需要离芯片处理[16][17][24][25][26]。

相比之下，我们的平台在单个气动驱动的PDMS芯片内集成了从粗细胞裂解物开始的免疫沉淀和直接珠子上胰蛋白酶消化过程。磁珠在流体静止的情况下移动，简化了过程控制，无需外部泵。该芯片完成了从粗细胞裂解物到消化肽的所有样品预处理步骤，为LC-MS/MS定量突变型和野生型BRAF做好准备。该平台通过自动化和微型化前端工作流程，减少了人工操作时间、试剂消耗和总体周转时间，从而实现了高效且经济的突变蛋白定量。

芯片设计与制造

用于蛋白质组学分析的样品制备芯片由三层PDMS组成（图1a）。顶层包含五个通过微通道连接的反应孔。中间层是一层110微米厚的PDMS膜，作为气动微混合器和芯片上阀门的驱动层。底层包括五个圆形气室，每个气室分为四个象限。施加负压会使膜向下移动，从而搅拌上方的液体

芯片操作优化

首先优化了抗体的加载过程。按照2.2节中的描述制备了抗BRAF抗体耦合的珠子，并用于在微混合器中从500微克HT-29蛋白（CE）中免疫沉淀BRAF 60分钟。测试了六种不同体积的珠子——10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125微升。免疫沉淀后，将珠子转移到微管中，依次用高盐缓冲液、低盐缓冲液和去离子水洗涤，并在最后一次洗涤时转移到新的微管中。去除上清液，然后...

结论

本研究提出了一个用于从细胞裂解物到质谱自动化蛋白质样品预处理的集成微流控平台。该设备直接从细胞裂解物开始，在约3小时内完成目标蛋白的免疫沉淀、多步骤洗涤和珠子上胰蛋白酶消化。本研究的主要贡献不在于引入新的单个模块，而在于展示了端到端工作流程的集成，显著减少了人工操作时间和总处理时间。

作者贡献声明

林彦恒：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。张恒云：方法学、实验研究。吴佳春：数据分析、数据管理。萧永进：数据分析、数据管理。文英豪：撰写 – 审稿与编辑、资源协调。余肇松：撰写 – 审稿与编辑、监督、概念构思

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢台湾国家科学技术委员会（NSTC）和长庚纪念医院提供的财务支持（NSTC编号：113-2221-E-182-011和BMRPC01）。