基于RPA-CRISPR/Cas12a技术的平台的开发与验证：用于快速、灵敏地检测鳗鱼疱疹病毒1型

《Aquaculture》：Development and validation of an RPA-CRISPR/Cas12a based platform for rapid and sensitive detection of Anguillid herpesvirus 1

AngHV快速检测平台开发及临床验证，整合RPA扩增与CRISPR/Cas12a特异性检测，实现30分钟内灵敏检测（50 copies/μL）和现场可视化诊断，显著优于传统PCR/qPCR方法。

　　

孙斌|陈强|葛俊青

福建省农业科学院生物技术研究所，福州，中国

摘要

鳗鱼疱疹病毒1型（AngHV）是一种具有包膜的双链DNA病毒，是导致鳗鱼“粘液脱落和出血性败血症”的病原体，给中国的鳗鱼养殖业造成了重大经济损失。由于缺乏商业上有效的药物和疫苗，早期和准确的AngHV诊断对于疾病预防和管理至关重要。然而，现有的诊断方法通常耗时较长或需要专门的设备。在这项研究中，我们开发了一种基于CRISPR的检测平台，能够快速灵敏地检测AngHV，该平台可以使用荧光或侧向流动检测方法进行读取。该平台结合了重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR/Cas12a系统，其中核酸目标通过RPA反应被扩增，随后通过Cas12a介导的切割进行检测，在蓝光/紫外光下产生可观察到的信号，或者通过侧向流动条（LFS）进行检测。该平台可以在40°C下30分钟内准确检测AngHV，与其他常见的水生病毒病原体没有交叉反应，并且检测限低至50拷贝/μL的AngHV。此外，使用传统的PCR、定量PCR（qPCR）和RPA-CRISPR/Cas12a平台对30个临床鳗鱼样本进行了评估。所开发平台的阳性检测率与qPCR一致，且比传统PCR更灵敏。总体而言，所开发的RPA-CRISPR/Cas12a检测平台为AngHV的现场诊断提供了一种快速、灵敏和可靠的方法，从而有助于改进鳗鱼养殖中的疾病监测和控制策略。

引言

中国是全球最大的养殖鳗鱼生产国，约占全球产量的70%（Chen等人，2024a）。主要养殖的鳗鱼种类包括日本鳗鱼（Anguilla japonica）、欧洲鳗鱼（Anguilla anguilla）和美洲鳗鱼（Anguilla rostrata）（Parchemin等人，2022）。然而，这种集约化的养殖方式为传染病的出现和传播创造了有利条件。自20世纪90年代以来，一种称为“粘液脱落和出血性败血症”的严重疾病频繁影响中国的鳗鱼养殖场，导致养殖户遭受重大经济损失（Ueno等人，1996）。临床上，这种疾病表现为过度粘液分泌、皮肤溃疡、皮下出血、头部水肿、鳃坏死和全身性出血性败血症。鳗鱼疱疹病毒1型（AngHV）是从受感染的鳗鱼中分离出来的（Ge等人，2014），随后被确定为该疾病的病原体（Chen等人，2021a）。

AngHV是养殖淡水鳗鱼中广泛存在的病原体，首次从养殖的日本鳗鱼中分离出来是在1990年（Sano等人，1990）。自首次鉴定以来，AngHV已在包括中国（Ge等人，2014）、韩国（Kim等人，2024）、波兰（Nguyen等人，2017）、越南（Panicz等人，2021）和印度尼西亚（Romadhona等人，2025）在内的多个国家和地区被检测到。AngHV属于疱疹病毒目（Herpesvirales）、异疱疹病毒科（Alloherpesviridae）和Cyvirus属（Zhang等人，2024c），并被国际病毒分类委员会（ICTV）重新命名为Cyvirus anguillidallo 1。结构上，AngHV具有多层结构，包括内核、二十面体衣壳、中间层膜以及来自宿主细胞膜的包膜（Sano等人，1990）。其基因组位于内核内，由大约248.5 kbp长的线性双链DNA组成，编码136个开放阅读框（ORFs）（Chen等人，2021b）。值得注意的是，ORF95基因编码AngHV病毒颗粒的主要包膜蛋白，并包含可用于诊断检测和治疗干预的保守序列（Chen等人，2021b）。

AngHV感染的临床和病理特征表现出相当大的变异性，受宿主种类和环境条件的影响（Guo等人，2022；Kim等人，2024；Nguyen等人，2017；Panicz等人，2021；Romadhona等人，2025）。重要的是，AngHV可以在鳗鱼群体中建立潜伏感染而不表现出明显的临床症状（Ruiz-de-Ybá?ez等人，2023）。这种无症状的潜伏状态给诊断带来了重大挑战，特别是在检测携带者中的低病毒载量时，因此迫切需要灵敏和高效的检测技术来促进疾病预防和控制。目前，已经建立了几种AngHV的检测方法，如传统的PCR（Rijsewijk等人，2005）、定量PCR（qPCR）（Li等人，2021）、重组酶辅助扩增（RAA）（Chen等人，2024b）、环介导等温扩增（LAMP）（Chen等人，2024a）和间接酶联免疫吸附试验（ELISA）（Van-Nieuwstadt等人，2001）。然而，这些方法在野外应用存在局限性：传统PCR需要高病毒载量的样本并进行琼脂糖凝胶电泳，qPCR需要复杂的仪器，而ELISA需要严格的实验室条件。等温核酸扩增技术，如LAMP和RAA，可以从极低拷贝数的样本中检测目标核酸，而无需复杂设备（Srivastava和Prasad，2023）。然而，LAMP需要较高的等温温度（通常为60–65°C），并且需要设计4–6对特异性引物，增加了非特异性扩增的风险，可能导致假阳性结果（Crego-Vicente等人，2024）。同样，RAA也需要精确的引物设计以减少非特异性扩增。因此，RAA和LAMP的扩增特异性高度依赖于引物，扩增产物通常需要通过整合其他策略进一步验证。

将规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白12a（Cas12a）系统与等温扩增技术相结合，成为一种通过同时目标扩增和信号增强实现快速核酸检测的有前景的方法（Srivastava和Prasad，2023）。CRISPR-Cas12a系统在序列特异性核酸识别和切割方面表现出显著的能力。在该系统中，crRNA引导Cas12a针对具有T富集的前间隔序列（PAM）（TTTV）的双链DNA目标（Ding等人，2025）。结合后，Cas12a表现出顺式切割和反式切割活性，后者能够切割周围的单链DNA（ssDNA）（Xiao等人，2025）。荧光染料和淬灭剂标记的ssDNA报告基因用于在切割时产生可检测的荧光信号，可以使用荧光检测仪器进行检测（Leung等人，2022）。或者，用生物素标记的ssDNA报告基因可以通过侧向流动条（LFS）进行检测（Mak等人，2016）。然而，CRISPR/Cas12a系统的一个关键限制是其在没有预先核酸扩增的情况下对低丰度目标的检测灵敏度不足（Zhang等人，2024a）。通过将等温扩增与CRISPR/Cas12a检测系统结合可以解决这一限制。重组酶聚合酶扩增（RPA）属于等温扩增技术，适用于此目的，因为它可以在温和温度（37–42°C）下在10–25分钟内高效扩增目标序列（Huang等人，2023）。RPA-CRISPR/Cas12a平台结合了RPA的高灵敏度和CRISPR/Cas12a的严格特异性，有效消除了由非特异性扩增引起的假阳性信号。这种互补方法使得诊断系统既具有高灵敏度又具有严格特异性。目前，RPA-CRISPR/Cas12a平台作为一种强大的诊断工具迅速发展起来，已成功应用于多种病原体的检测，例如细菌病原体（如Vibrio harveyi、Pseudomonas plecoglossicida）（Zhong等人，2025；Jiang等人，2025）、病毒（如大黄鱼虹彩病毒、白斑综合征病毒和罗非鱼湖病毒）（Zhang等人，2024b；Wang等人，2023；Sukonta等人，2022）和寄生虫（如Clonorchis sinensis）（Huang等人，2023），展示了其在水生疾病监测中的多功能性。

在这项研究中，我们开发了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的诊断平台，用于AngHV的可视化检测，并评估了其灵敏度、特异性、重复性和在临床环境中的适用性。该平台提供了两种互补的读数模式：（1）在蓝光/紫外光下可视化荧光信号，用于实验室确认；（2）LFS检测，无需设备即可进行现场应用。总体而言，这项研究提供了一种快速、灵敏和可靠的AngHV现场检测方法，具有显著提升鳗鱼养殖疾病预防和控制的潜力。

部分摘录

病毒、临床样本和DNA提取

本研究中使用的病毒株在我们实验室中分离并维持，包括AngHV（AngHV-FJ株）（Ge等人，2014）、美洲鳗鱼Adomavirus（AEAdoV，AEAdoV-FJ株）（Yang等人，2021）、Rana grylio病毒（RGV，RGV-FJ株）（Zhang等人，2022）、鳗鱼虹彩病毒（EIV，201019株）（未发表数据）和锦鲤疱疹病毒（KHV，Gz1301株）（Li等人，2014）。为了病毒繁殖，使用鳗鱼卵巢（EO）细胞系感染了AngHV、AEAdoV和EIV。

引物评估和RPA条件优化

选择ORF95基因作为引物设计的目标区域，因为该基因具有高度保守的序列。设计了三对引物（RPA-F1/R1、RPA-F2/R2和RPA-F3/R3）并筛选了它们的RPA扩增效果。初步评估表明，RPA-F1/R1对成功扩增了目标序列，在琼脂糖凝胶电泳中产生了明显的条带（图2A，D）。扩增产物的测序确认了目标特异性，验证了RPA-F1/R1是最优选择。

讨论

AngHV是一种重要的病毒病原体，由于其高发病率和死亡率，对鳗鱼养殖构成了严重威胁（Chen等人，2021a）。控制AngHV疾病的一个主要挑战是它能够在鳗鱼体内建立潜伏感染，这些感染通常无症状，从而使得早期检测变得复杂。一旦出现临床症状，疾病会迅速进展，这突显了及时和准确诊断工具的迫切需求。在这项研究中，我们

CRediT作者贡献声明

孙斌：撰写——原始草稿、验证、方法学、调查、正式分析。陈强：资源获取、调查、正式分析。葛俊青：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、概念化。

未引用的参考文献

Chang等人，2002 Ji等人，2025

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。 作者是Scientific Reports的编委会成员/主编/副主编/客座编辑，未参与本文的编辑审查或发表决定。

致谢

本工作得到了福建省公共利益基础研究基金（2023R1081）、福建省农业科学院“5511”协同创新项目（XTCXGC2021013）和国家自然科学基金（U24A20459）的支持。