棉花WRKY17转录因子识别DNA的结构基础：揭示IId类WRKY蛋白特异性结合的新机制

《Biochemical Journal》：Structural basis for sequence-specific DNA recognition by a group IId WRKY transcription factor GhWRKY17 in cotton

本研究针对棉花IId类WRKY转录因子GhWRKY17识别靶基因启动子W-box元件的结构基础不明这一科学问题，通过X射线晶体学首次解析了GhWRKY17 WRKY结构域与GhHOX3启动子DNA的1.8 ?高分辨率复合物结构，揭示了其通过β2和β3链协同作用形成复杂氢键网络特异性识别扩展G/TTTGACC模体的新机制，该研究不仅为理解棉花纤维发育的转录调控提供了结构范式，也为通过转录调控工程改良棉花纤维性状提供了分子见解。

　　

在植物王国中，转录因子如同基因表达的指挥家，精准调控着植物的生长发育、应激反应等重要生命活动。其中，WRKY转录因子家族是植物特有的一类关键调控因子，它们通过其保守的WRKY结构域特异性结合靶基因启动子中的W-box顺式作用元件（C/TTGACC/T），在植物防御和发育过程中扮演着核心角色。在陆地棉（Gossypium hirsutum）中，IId类成员GhWRKY17通过激活下游靶基因如GhHOX3等，正调控棉花纤维的起始和伸长。然而，尽管功能研究已证实GhWRKY17的重要性，但其识别DNA的特异性分子机制，特别是与其他WRKY亚群相比有何独特之处，长期以来一直是个未解之谜。

为了揭开这一谜团，苏州大学药学院江苏省脑疾病药物发现与转化研究重点实验室的研究团队在《Biochemical Journal》上发表了他们的最新研究成果。研究人员综合运用X射线晶体学、等温滴定量热法（ITC）和功能突变分析等技术，成功解析了GhWRKY17 WRKY结构域与GhHOX3启动子W-box双链DNA的复合物晶体结构，这是首个报道的IId类WRKY转录因子复合物结构，也是陆地棉中首个结构解析的WRKY转录因子。

研究团队采用的主要关键技术方法包括：蛋白表达纯化（使用pET28载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GhWRKY17 WRKY结构域并通过镍柱亲和层析与分子排阻层析纯化）、等温滴定量热法（ITC，定量分析蛋白与DNA的亲和力）、X射线晶体学（在加拿大光源和上海同步辐射装置收集数据，通过分子置换法解析1.8 ?分辨率结构）和电泳迁移率变动分析（EMSA，验证序列特异性结合）。

GhWRKY17 WRKY结构域结合靶启动子中的W-box序列

通过ITC实验证实，GhWRKY17 WRKY结构域（残基239-304）能够以微摩尔级的亲和力直接结合GhHOX3和GhMYB109启动子中的W-box序列，其解离常数（K_d）介于4.4至12 μM之间，表明WRKY结构域具有独立于全长蛋白背景的W-box识别能力。

GhWRKY17 WRKY-dsDNA复合物的晶体结构

研究人员成功解析了GhWRKY17 WRKY结构域与12 bp HOX3-1 W-box dsDNA的1.8 ?分辨率晶体结构（PDB代码：9M0K）。不对称单元包含两个WRKY单体和一条DNA双链，但仅有一个单体直接参与DNA结合。每个单体采用典型的WRKY折叠，由四个反平行β链（β2-β5）组成，并通过C₂-H₂类锌指模体稳定结构。有趣的是，两个WRKY单体通过反平行β5-β5′相互作用形成同源二聚体，但分子排阻色谱（SEC）分析显示其在溶液中为单体状态，表明二聚化可能是结晶诱导或浓度依赖的现象。

GhWRKY17 WRKY结构域与W-box dsDNA的原子水平相互作用网络

结构分析揭示了β2链上的保守²⁴⁹WRKYGQK²⁵⁵基序介导了核心TGAC识别的关键DNA接触。关键残基（R250、K251、Y252、Q254、K255、R264、Y266、Y267）与DNA之间形成了复杂的氢键网络，其中R250表现出双构象状态，增强了相互作用的多样性。该结构首次展示了WRKY结构域同时识别正义链和反义链上TGAC模体的独特特性，且其DNA结合主要依赖于氢键作用，而非其他亚群中常见的广泛疏水相互作用。

突变分析揭示关键结合决定因素

通过点突变和ITC分析，研究人员发现Y252、Q254、K255、R264、Y266、Y267和R278等残基的丙氨酸取代完全破坏了DNA结合，而K258和K268的突变仅适度降低结合亲和力，揭示了这些残基在DNA识别中的不可或缺性或辅助性作用。

W-box的序列特异性识别

EMSA实验证实，核心TGAC序列的突变完全破坏DNA结合，而侧翼核苷酸的分析显示，GhWRKY17 WRKY优先结合G/TTTGACC序列，其中T4和T9位点的特异性识别对其结合特异性至关重要，这与之前报道的其他WRKY亚群的核苷酸偏好性存在显著差异。

WRKY亚群间的结构和功能分化

与已解析的I类（AtWRKY4、AtWRKY1）、IIa类（AtWRKY18）和III类（OsWRKY45）WRKY-DNA复合物的比较分析表明，虽然所有WRKY结构域共享保守的β片层DNA结合支架，但各亚群在寡聚化策略、二级结构利用和相互作用化学（氢键 vs. 疏水作用）方面存在显著差异。GhWRKY17的双链结合和以氢键介导的特异性相互作用代表了IId类成员区别于其他WRKY亚群的新机制特征。

研究结论与讨论部分强调，该研究首次解密了IId类WRKY转录因子GhWRKY17识别DNA的分子逻辑，揭示了其通过保守原则和亚群特异性创新相结合的方式实现序列特异性识别。这些发现不仅建立了理解IId类WRKY功能的结构范式，强调了亚群特异性研究的必要性，而且为通过转录调控工程优化棉花纤维性状提供了精准的分子蓝图。该研究增进的对WRKY蛋白DNA识别机制多样性的理解，对作物遗传改良具有重要的理论指导意义。