《Biochemistry and Biophysics Reports》：A simple and rapid method for generating antibodies against bovine alphaherpesvirus 1 viral proteins through immunization with virus-infected murine cells
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本研究针对牛α疱疹病毒1型（BoAHV-1）特异性抗体种类有限、传统制备方法复杂耗时的问题，开发了一种利用病毒感染的小鼠细胞直接免疫小鼠以快速生成抗病毒蛋白抗体的新方法。研究证实BoAHV-1可感染LA795和MC38等鼠源细胞系，并通过腹腔或皮下注射免疫成功诱导产生可特异性识别病毒蛋白的高水平抗体，为病毒蛋白功能研究提供了简便、经济的抗体制备方案。
牛，作为重要的经济动物，其健康关乎全球畜牧业的稳定与发展。然而，一种名为牛α疱疹病毒1型（Bovine alphaherpesvirus 1, BoAHV-1）的病原体却时常给养牛业带来沉重打击。这种病毒属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，能引起牛的多系统炎症性疾病，导致显著的经济损失。深入研究BoAHV-1的感染和致病机制，对于开发有效的防控策略至关重要，而在这个过程中，特异性抗体是不可或缺的研究工具。它们如同精准的“分子探针”，帮助科学家们在细胞乃至动物体内追踪病毒蛋白的踪迹，解析其功能。遗憾的是，目前市面上能够买到的BoAHV-1抗体仅针对极少数病毒蛋白，这极大地限制了对该病毒生命周期的全面探索。
传统制备抗体的方法通常涉及表达和纯化重组蛋白作为抗原，这一过程既复杂又耗时。能否找到一条更快捷的途径呢？研究人员将目光投向了病毒本身的一个有趣特性：BoAHV-1被发现能够感染多种肿瘤细胞系，甚至包括一些小鼠来源的细胞。这激发了一个巧妙的设想：基于免疫耐受的原理（即机体对自身蛋白通常不产生强烈的免疫反应），如果使用被BoAHV-1感染的小鼠细胞来免疫小鼠，小鼠的免疫系统可能会忽略作为“自身”成分的小鼠细胞蛋白，而集中火力攻击“非我”的病毒蛋白，从而高效地产生针对病毒蛋白的抗体。这种方法有望绕过重组蛋白制备的繁琐步骤。
为了验证这一设想，来自河北大学的研究团队在《Biochemistry and Biophysics Reports》上发表了一项研究。他们首先证实了BoAHV-1确实能够感染两种小鼠肿瘤细胞系——肺腺癌细胞LA795和结肠腺癌细胞MC38。通过免疫印迹（Western Blot）和免疫荧光（Immunofluorescence Assay, IFA）分析，他们在感染的细胞中清晰地检测到了病毒蛋白的表达。接着，研究团队分别通过腹腔注射和皮下注射两种途径，用病毒感染后的LA795或MC38细胞免疫BALB/c小鼠。
研究结果显示，这种免疫策略成功地诱导小鼠产生了能够特异性识别在牛肾（MDBK）细胞中合成的BoAHV-1病毒蛋白的抗体。免疫印迹分析表明，不同小鼠个体产生的抗体所能识别的病毒蛋白在数量和分子量上有所差异，提示存在个体免疫反应的多样性。值得注意的是，通过腹腔注射途径免疫似乎能更有效地引发针对更多种类病毒蛋白的抗体反应。此外，通过腹腔注射病毒感染LA795细胞所获得的抗体血清，在免疫荧光实验中能够很好地用于检测病毒感染的细胞，显示出其在应用中的潜力。
本研究建立的方法，核心在于利用病毒感染的同源动物细胞作为免疫原，关键技术方法包括：1） 使用BoAHV-1毒株感染小鼠源LA795和MC38细胞系；2） 通过腹腔或皮下注射途径，用上述病毒感染细胞免疫BALB/c小鼠（样本来源：购自Charles River公司）；3） 采用免疫印迹（Western Blot）和免疫荧光（IFA）技术系统鉴定小鼠血清中抗体的特异性反应活性。
3.1. BoAHV-1感染小鼠细胞系LA795
研究人员发现，BoAHV-1能够感染小鼠肺腺癌细胞系LA795，并在感染48小时后引起明显的细胞病变效应（Cytopathic Effect, CPE）。通过免疫印迹，使用商品化的gD特异性单克隆抗体和针对病毒颗粒的多抗血清，在感染的LA795细胞中检测到了病毒蛋白的表达，特别是gD蛋白（约70 kDa）和一些病毒颗粒相关蛋白。免疫荧光分析进一步直观地证实了病毒蛋白在感染细胞内的特异性表达，荧光强度定量分析显示感染后信号增强约2.04倍。
3.2. BoAHV-1感染小鼠细胞系MC38
研究也评估了BoAHV-1对小鼠结肠腺癌细胞系MC38的感染性。虽然典型的CPE不如在LA795细胞中显著，但免疫印迹分析清晰地显示了多条仅在病毒感染的MC38细胞中出现的特异性蛋白条带，分子量分布在不同范围。免疫荧光结果同样证实了病毒蛋白的特异性表达，且荧光强度增强非常显著（约7.90倍）。这些结果表明MC38细胞也支持BoAHV-1病毒的复制或晚期基因的完整表达。
3.3. 通过免疫印迹分析鉴定免疫小鼠血清中的抗体
分别通过腹腔注射（使用病毒感染LA795细胞）和皮下注射（使用病毒感染LA795或MC38细胞）免疫小鼠后，收集血清并通过免疫印迹分析其特异性。结果显示，大多数免疫小鼠的血清均能识别MDBK细胞中表达的BoAHV-1病毒蛋白，但识别的蛋白条带数量和分子量因免疫途径、所用细胞系以及个体小鼠而异。腹腔注射途径似乎能诱导产生针对更多样化病毒蛋白的抗体。预免疫小鼠的血清则只显示非特异性反应。
3.4. 通过免疫荧光分析鉴定免疫小鼠血清中的抗体
进一步利用免疫荧光评估所生成抗体的应用价值。发现通过腹腔注射病毒感染LA795细胞所获得的抗体血清（特别是2号小鼠）能有效用于免疫荧光检测，在病毒感染的MDBK细胞中显示出清晰的特异性信号，而在模拟感染的细胞中背景很低。然而，通过皮下注射获得的某些血清（特别是使用MC38细胞免疫的）在免疫荧光中表现出较高的非特异性背景，影响了其用于特异性检测的效果。
综上所述，本研究首次证实BoAHV-1能够感染小鼠LA795和MC38细胞系，并成功开发了一种通过免疫小鼠同源病毒感染细胞来快速生成抗病毒蛋白抗体的新策略。该方法巧妙地利用了机体对自身蛋白的免疫耐受，使免疫反应聚焦于病毒抗原。研究结果表明，该方法能够诱导产生针对多种BoAHV-1蛋白的特异性抗体，其效果受免疫途径和个体差异影响。与需要表达和纯化重组抗原的传统方法相比，此方法更为简单、快速且经济。
讨论部分指出，观察到的非特异性条带可能与病毒感染的肿瘤细胞中某些宿主蛋白的免疫原性改变有关。抗体反应的多样性（不同小鼠识别不同蛋白）提示了病毒蛋白免疫原性的差异以及可能存在免疫优势现象。尽管基于分子量的推测可能指向gB、gD等特定糖蛋白，但抗体的确切靶标仍需进一步鉴定。此外，研究中通过使用高感染复数（MOI）的病毒、UV照射处理细胞以及利用BoAHV-1本身的溶瘤特性，有效降低了使用肿瘤细胞进行免疫可能带来的成瘤风险。
该研究建立的抗体生成策略不仅为BoAHV-研究提供了宝贵的工具，其原理也可能适用于其他能够感染同源动物细胞系的病毒（如单纯疱疹病毒1型、麻疹病毒、腺病毒等），为病毒学工具抗体的快速制备提供了新思路。这项工作凸显了利用病毒生物学特性简化实验流程的创新性，对推动病原体基础研究和抗病毒工具开发具有重要意义。
