《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Nanodomain formation in lipid bilayers I: Quantifying the nanoscopic miscibility transition with FRET
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本研究提出一种基于F?rster共振能量转移（FRET）的可靠方法，用于测定脂质双层混合物的纳米尺度混溶性转变温度（nm-Tmix）。通过模型比较和信息论测试，区分了纳米尺度与微米尺度转变，并验证临界集群尺寸约为10 nm。配套的开源软件简化了数据分析流程。
艾米丽·H·蔡松（Emily H. Chaisson）|迪克莎·梅塔（Deeksha Mehta）|弗雷德里克·A·赫伯勒（Frederick A. Heberle）
美国田纳西大学诺克斯维尔分校化学系，37916，田纳西州
摘要
我们提出了一种稳健且易于使用的方法，通过FRET测量来确定脂质双层混合物的纳米级混溶性转变温度（nm-Tmix）。该方法依赖于使用自由扩散的荧光供体和受体脂质，这些脂质在共存相之间非均匀分布。当满足这一条件时，样品通过转变过程中发生的脂质聚集变化会导致探针的空间分布突然改变，进而导致FRET信号也发生突然变化。然后可以使用现象学分段函数对FRET与温度的数据进行建模，以描述信号在nm-Tmix以上和以下的变化情况。通过晶格模拟，我们发现当脂质簇的大小超过一个临界阈值时，转变就会发生，该阈值大约等于供体/受体对之间的F?rster距离的两倍，即约10纳米。由于其他与横向组织无关的温度依赖性因素（如脂质分子面积的变化和供体的光物理性质）也会影响FRET信号，我们还使用了一个更简单的均匀混合模型来拟合数据。基于信息论的测试比较了均匀模型和相分离模型的拟合质量，为客观评估给定样品在感兴趣的温度范围内是否发生纳米级混溶性转变提供了一个直接且稳健的标准。我们强调了通过FRET（或具有类似空间分辨率的方法）确定的nm-Tmix与通过衍射限制光学技术确定的微米级转变温度（μm-Tmix）之间的区别。分析软件可从在线仓库免费获取。
引言
F?rster共振能量转移（FRET）是一种光物理过程，其中供体荧光团D将其激发能量传递给附近的受体荧光团A。当D和A紧密接触时，通过FRET机制实现供体退激的概率很高，但该概率与D-A间距的六次方成反比。FRET效率达到50%时的距离称为F?rster距离R0，它是特定D/A对的特性参数，通常在2-10纳米范围内。因此，FRET对分子长度尺度非常敏感，这使得该技术在许多生物学应用中非常有用[1]、[2]。
FRET常用于膜生物物理学研究，以了解体外[3]、[4]、[5]、[6]、[7]和体内[9]、[10]、[11]中脂质和蛋白质的空间组织结构。FRET效率的变化通常可以解释为在不同条件下荧光标记物种（通常是脂质或蛋白质）的共定位或分离。在膜相行为的背景下，FRET对混溶性转变开始时脂质聚集的突然变化以及由此导致的荧光供体和受体脂质的空间重新分布非常敏感。因此，已经开发了多种FRET方法来检测在固定温度下改变组成时的相界[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]，或在固定组成下改变温度时的相界[19]、[20]、[21]、[22]。关于这些方法的使用及其相对优缺点的详细讨论可以在几篇综述文章中找到[23]、[24]、[25]。
在这里，我们描述了一种稳态探针分配FRET的变体，用于测量混溶性转变温度（Tmix），该方法只需要一个样品和一台荧光光谱仪。该方法利用了样品通过Tmix时受体荧光发射的突然变化。我们强调同时使用两种具有互补分配行为的探针对，这有助于区分真正的混溶性变化和其他可能影响FRET效率的因素，从而最小化误解的可能性。通过晶格模拟，我们将观察到的FRET信号变化与大约10纳米的最小簇大小联系起来，这与纳米级混溶性的解释一致。
化学试剂
磷脂1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DOPC）、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（POPC）和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DPPC）购自Avanti Polar Lipids（阿拉巴斯特，阿拉巴马州）。胆固醇购自Nu-Chek Prep（伊利西安，明尼苏达州）。1-棕榈酰-2-(二吡咯甲烯硼二氟化物)十一酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（TFPC）也购自Avanti Polar Lipids；1,1'-十二烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羧花青素和4-氯苯也用于实验。
结果与讨论
我们的结果如下组织：首先，我们对三种具有不同横向不均匀性的样品展示了该方法：(1) DOPC，作为均匀膜的对照；(2) DPPC/DOPC/Chol 40/40/20摩尔%，这是一种典型的Ld+Lo混合物，在10°C时通过荧光显微镜观察呈均匀状态[36]，但用FRET探测时显示出不均匀性[37]，表明存在纳米级相分离。
总结
我们提出了一种易于实施的FRET方法，用于基于成熟的信息论模型选择标准来评估膜样品的相行为。免费提供的代码既实现了测试，又在适当情况下报告了nm-Tmix的值，从而简化了分析并使得相行为的解释更加一致。我们的方法同时使用了两种具有互补分配行为的探针对（即一种探针对...）
CRediT作者贡献声明
艾米丽·H·蔡松（Emily H. Chaisson）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、软件开发、方法论设计、实验研究、数据分析、概念构建。迪克莎·梅塔（Deeksha Mehta）：撰写 – 审稿与编辑、实验研究、数据分析。弗雷德里克·A·赫伯勒（Frederick A. Heberle）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、项目监督、软件开发、资金获取、数据分析、概念构建。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了NIH资助（R01GM138887，资助对象为F.A.H.）。
