基于Cu-BTC稳定的血红素纳米酶的光电化学与比色双重模式免疫传感器，用于血清中神经元特异性烯醇酶的即时检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Photoelectrochemical and colorimetric dual-mode immunosensor based on Cu-BTC-stabilized hemin nanozyme for point-of-care detection of neuronal-specific enolase in serum

双模光电化学-显色免疫传感器用于神经元特异性烯醇化酶检测，通过磁性Fe3O4@Bi2S3纳米颗粒和Cu-BTC@hemin复合物实现双信号协同检测，增强灵敏度与自验证机制，临床血清样本验证显示高特异性与稳定性。

　　

肖凯|黄思彤|孙佳|刘珍|孟乐霞

中南林业科技大学化学与化学工程学院，中国长沙410004

摘要

作为全球死亡的主要原因之一，脑卒中（CS）需要及时诊断，而快速准确地检测神经元特异性烯醇酶（NSE）是有效干预的关键。为了解决这一问题，提出了一种新型的双模式光电化学和比色（PEC-CL）免疫传感器，用于现场检测NSE。该传感平台使用经过初级抗体功能化的磁性Fe₃O₄@Bi₂S₃纳米颗粒（NPs）作为PEC活性捕获探针，以及与次级抗体结合的血红素包封的铜基金属有机框架（Cu-BTC@hemin）作为多功能信号探针。当NSE结合时，会触发特定的双信号转导过程：电子从血红素转移到Bi₂S₃，导致PEC信号减弱，同时上清液中的血红素催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化，产生比色响应。该传感器表现出优异的性能和内在的自验证能力。此外，这种双模式传感器在临床样本中具有稳定的NSE定量能力。其在特异性、重复性和复杂血清基质中的稳健性方面的表现，为下一代脑卒中现场诊断技术奠定了坚实的基础。同时，它也为其他生物标志物的多模式生物传感器的开发提供了通用蓝图，从而加速了脑血管疾病精准医学的进展。

引言

脑卒中（CS）是一种由短暂性脑缺血发作、心房颤动和糖尿病等疾病引起的脑血管疾病（Abramo等人，2015年；Foo等人，2020年；Xiong等人，2022年）。及时诊断至关重要，因为早期干预可以减缓疾病进展并缓解症状（Miyamoto等人，2023年）。研究表明，NSE浓度与卒中后的神经损伤程度相关（Wang等人，2018b年）。因此，NSE是预测短期临床状况和长期恢复前景的重要指标。生物传感器技术的发展通过敏感的NSE检测彻底改变了脑血管损伤疾病的诊断方法，各种分析技术都取得了令人鼓舞的结果，包括荧光（FL）、电化学（EC）、电化学发光（ECL）、比色（CL）和PEC检测平台（Lin等人，2019年；Tang等人，2022年；Wang等人，2024年；Zou等人，2024年）。尽管现有的单模式生物传感器具有足够的灵敏度进行定量评估，但它们存在一些固有的局限性，如易受环境干扰、背景信号高以及由于操作者差异、非标准化程序或不一致的检测条件导致的假阳性/阴性结果。

为了解决这些问题，最近的研究进展集中在开发通过互补分析技术的协同整合来实现功能的双模式检测系统（Dong等人，2024年）。典型的例子包括FL-CL、PEC-EC、PEC-CL、EC-CL、FL-ECL和ECL-EC配置（An等人，2025年；Li等人，2026年；Luo等人，2023年；Shan等人，2022年；Tang等人，2024年；Xiao等人，2024年；Xie等人，2025年）。这些双响应平台利用独立的信号转导途径通过正交检测机制实现自验证，从而提高分析可靠性。特别值得注意的是PEC-CL双模式策略，它结合了两种技术的独特优势：PEC检测具有高灵敏度和宽线性范围，而CL系统提供直观的视觉读数和良好的操作稳定性。这些互补模式的整合创建了一个具有增强诊断准确性和稳健性的协同分析平台。

近年来，作为结合磁性和可见光响应的核心壳结构，磁性半导体纳米材料作为新型PEC材料受到了广泛关注（Li等人，2020a年；Li等人，2020b年；Ren等人，2024年）。这种光电学和磁性的多功能集成特性，结合多种PEC信号增强机制，为构建高灵敏度的“信号开启”型生物传感平台提供了理想的材料基础。血红素的高催化活性使其成为纳米酶比色传感器中的有前景的信号元件（Li等人，2025年）。值得注意的是，血红素在PEC传感系统中也显示出作为信号增强剂的潜力，可以显著提高传感器的灵敏度（Lv等人，2017年）。然而，在实际应用过程中，它仍然面临化学稳定性和信号放大不足的问题（Li等人，2018年）。特别是，金属有机框架（MOFs）由于其高度有序的孔结构、可控的孔径和高的比表面积，已成为固定生物活性分子的理想载体（Guo等人，2023年；Nguyen等人，2024年；Zhou等人，2020年）。将血红素封装在MOFs中不仅显著提高了其化学稳定性，还通过高密度加载功能分子实现了信号放大效果，从而为开发高性能PEC-CL传感器奠定了材料基础。例如，Wang等人开发了一种基于血红素的PEC-CL双模式生物传感器，利用纳米酶驱动的Fenton化学反应来启动RAFT聚合，以放大检测caspase-3活性（Zheng等人，2025年）。尽管有这些有希望的发展，但利用这种机制在临床样本中检测NSE的PEC-CL双模式传感器的开发仍然很大程度上未被探索，尤其是在需要高灵敏度和诊断可靠性的复杂生物基质中的应用。

在这项工作中，我们提出了一种新型的双模式“PEC开启/CL关闭”免疫传感器，用于快速灵敏地检测NSE。该平台将高特异性抗体与两种功能性纳米复合材料结合：磁性Fe₃O₄@Bi₂S₃作为PEC基底，以及血红素包封的Cu-BTC用于双信号调节（图1）。这种创新的调节器在一个单元中结合了PEC增强控制和CL探测，实现了精确的信号调节和检测。这种协同作用建立了独特的双信号输出自验证机制，与传统单模式免疫传感器相比，显著提高了灵敏度、准确性和可靠性。重要的是，该设计保留了临床应用所需的基本特征：操作简单，并在复杂生物基质（如人血清）中表现出稳健的性能。这项工作不仅建立了一个稳健的分析平台，还为开发先进的脑卒中多模式诊断系统提供了一个灵活且可适应的平台。

部分摘录

Fe₃O₄@Bi₂S₃纳米复合材料的制备

磁性Fe₃O₄纳米颗粒是通过改进的溶热法合成的。在典型的合成过程中，将三氯化铁（3 mmol）和柠檬酸钠（1.36 mmol）溶解在乙二醇（40 mL）中，然后加入醋酸钠（29.2 mmol），并在持续搅拌下进行反应。剧烈搅拌30分钟后，将均匀溶液密封在100 mL特氟龙内衬的高压釜中，在200°C下进行10小时的水热处理。得到的黑色Fe₃O₄纳米球

材料表征

使用一系列互补的分析技术（包括扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射仪（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）研究了Fe₃O₄@Bi₂S₃的形态和结构演变。如图1A所示，制备的磁性Fe₃O₄呈现出均匀的近似球形形态，平均粒径约为350 nm。相比之下，如图1B和C所示，

结论

本研究成功开发了一种新型的双模式（PEC-CL）免疫传感器，用于灵敏地检测NSE。该平台使用Fe₃O₄@Bi₂S₃纳米颗粒作为光活性基底，Cu-BTC@hemin作为双功能探针，通过相关的CL和PEC信号实现自验证的定量。优化的检测方法表现出高灵敏度和特异性，能够在临床血清样本中快速定量NSE。关键的是，两种检测模式对NSE水平显示出 strong 一致性

CRediT作者贡献声明

孙佳：正式分析，数据管理。黄思彤：正式分析，概念化。孟乐霞：方法学，资金获取，正式分析。刘珍：正式分析，概念化。肖凯：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原稿，监督，项目管理，资金获取，概念化

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

√作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22204042）、中南林业科技大学的人才引进研究启动基金（202301030171）、河南省科学技术项目（252102310317）以及湖南省教育厅（24C0111）的财政支持。感谢Scientific Compass（www.shiyanjia.com）提供的宝贵帮助。