《Brain Research》：HSP47 inhibitor Col003 inhibits glial scar formation and improves neurological function in ischemic stroke in rats
编辑推荐：
本研究针对缺血性脑卒中慢性期胶质瘢痕形成阻碍神经修复的难题，探讨了HSP47抑制剂Col003的治疗潜力。研究发现Col003能显著抑制反应性星形胶质细胞增殖迁移，降低GFAP、neurocan和phosphacan表达，并通过RNA-seq证实其作用与JAK2/STAT3通路相关。该研究为慢性期脑卒中提供了新的治疗策略。
当大脑的血液供应突然中断，就会发生缺血性脑卒中，这是一种具有高致残率、高死亡率和高复发率的严重疾病。目前，针对急性缺血性脑卒中的治疗手段已取得一定进展，但对于慢性期患者的有效治疗策略仍显不足。在脑卒中的慢性阶段，大脑损伤区域周围会形成一种特殊的结构——胶质瘢痕。这种瘢痕主要由反应性星形胶质细胞、小胶质细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、免疫细胞及细胞外基质组成，虽然在一定程度上限制了损伤扩散，但也严重阻碍了轴突再生和神经修复，成为神经功能恢复的主要障碍。
反应性星形胶质细胞是胶质瘢痕的主要组成部分。在脑卒中急性期，星形胶质细胞被激活，有助于限制炎症和毒性物质的扩散；然而在慢性期，这些细胞过度增殖和迁移，形成成熟的胶质瘢痕。热休克蛋白47（HSP47）是一种胶原特异性分子伴侣，在纤维化过程中发挥关键作用。先前研究表明，HSP47在缺血后的脑皮质中表达增加，并在反应性星形胶质细胞中表达，持续存在于胶质瘢痕中。然而，HSP47在缺血性脑卒中胶质瘢痕形成中的具体作用尚不清楚。
为了解决这一问题，广西医科大学第一附属医院神经内科的研究团队在《Brain Research》上发表了一项研究，探讨了HSP47抑制剂Col003对缺血性脑卒中后胶质瘢痕形成的影响及其机制。
研究人员采用了几项关键技术方法开展本研究：使用SD（Sprague-Dawley）大鼠建立大脑中动脉闭塞（MCAO）模型模拟缺血性脑卒中；通过体外培养原代皮质星形胶质细胞并进行氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）处理模拟脑缺血环境；采用尾静脉注射方式给予HSP47抑制剂Col003进行干预；通过Western blot、免疫荧光等技术检测蛋白表达变化；利用RNA测序（RNA-seq）和KEGG通路富集分析探索潜在作用机制；并通过神经功能评分（Bederson评分和握绳测试）评估行为学改善情况。
3.1. Hsp47在OGD/R诱导的星形胶质细胞和MCAO大鼠的胶质瘢痕中增加
研究发现，在OGD/R诱导的星形胶质细胞中，HSP47表达显著增加。同时，在大鼠MCAO模型术后第1、7和14天，梗死周边区域的HSP47表达也明显升高，表明HSP47在胶质瘢痕形成过程中可能发挥重要作用。
3.2. MCAO大鼠胶质瘢痕的变化
免疫荧光分析显示，MCAO术后7天，梗死周边区域出现密集排列的星形胶质细胞，细胞突起朝向缺血核心方向延伸。至14天时，胶质瘢痕边界处的星形胶质细胞形态与7天时相似，但突起更加延长，表明胶质瘢痕逐渐成熟。
3.3. Col003在大鼠体内的药代动力学
药代动力学实验表明，50μM Col003在大鼠体内的清除半衰期为5.26±0.16小时。根据这一结果，研究中选择每天三次通过尾静脉注射Col003，以维持有效血药浓度。
3.4. Col003减轻脑缺血再灌注损伤并改善大鼠神经功能
行为学测试结果显示，与vehicle组相比，50μM和100μM Col003治疗组在MCAO后第1、7和14天的Bederson评分和握绳测试得分均显著改善。同时，Col003治疗组脑萎缩体积明显减小，HE和Nissl染色显示神经元死亡减少。这些结果表明Col003对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，并能改善神经功能。
3.5. Col003抑制缺血再灌注损伤大鼠的胶质瘢痕形成
Western blot和免疫荧光分析显示，Col003治疗显著降低了梗死周边区域胶质瘢痕标志物GFAP、neurocan和phosphacan的表达，表明Col003能抑制缺血性脑卒中后胶质瘢痕的形成。
3.6. Col003抑制OGD/R诱导的星形胶质细胞增殖和迁移
细胞实验表明，Col003能浓度依赖性地抑制OGD/R诱导的星形胶质细胞增殖，在50μM浓度下即可产生显著抑制作用。划痕实验结果显示，Col003处理显著降低了星形胶质细胞的迁移速率，表明Col003通过抑制星形胶质细胞的增殖和迁移来抑制胶质瘢痕形成。
3.7. Col003减少OGD/R诱导的星形胶质细胞胶质瘢痕形成
体外实验进一步证实，Col003能降低OGD/R诱导的星形胶质细胞中GFAP、neurocan和phosphacan的表达，与体内实验结果一致，表明Col003直接抑制星形胶质细胞参与胶质瘢痕形成的能力。
3.8. Col003治疗后的RNA-seq分析
RNA-seq分析发现，Col003治疗组与vehicle组之间有388个差异表达基因，其中240个基因下调，148个基因上调。KEGG通路富集分析显示，这些差异基因主要富集在HIF-1、JAK-STAT、cAMP和PPAR等信号通路。
3.9. Col003下调OGD/R后星形胶质细胞中的JAK2/STAT3信号通路
Western blot分析显示，OGD/R诱导的星形胶质细胞中JAK2和STAT3的磷酸化水平显著升高，而Col003处理能显著抑制这种磷酸化激活。
3.10. CA1对OGD/R诱导的星形胶质细胞活力的影响
JAK2激动剂Coumermycin A1（CA1）在浓度超过10μM时对OGD/R诱导的星形胶质细胞产生毒性作用，因此选择5μM CA1进行后续实验。
3.11. Col003通过JAK2/STAT3通路抑制OGD/R诱导的星形胶质细胞胶质瘢痕形成
当使用CA1激活JAK2通路后，Col003对JAK2/STAT3磷酸化的抑制作用被逆转，同时GFAP、neurocan和phosphacan的表达也相应增加。这一结果表明Col003通过抑制JAK2/STAT3通路来抑制胶质瘢痕形成。
研究结论与讨论部分指出，本研究首次证实HSP47在缺血性脑卒中后胶质瘢痕形成过程中表达增加，其抑制剂Col003能通过抑制JAK2/STAT3通路，减少反应性星形胶质细胞的增殖和迁移，降低胶质瘢痕相关标志物表达，从而改善神经功能恢复。这一发现为慢性期缺血性脑卒中的治疗提供了新思路。
值得注意的是，虽然本研究初步证明了Col003抑制胶质瘢痕形成的效果，但仍存在一些局限性。例如，研究未探讨Col003对小胶质细胞的直接影响；所有动物在再灌注后立即接受Col003治疗，因此早期神经功能改善可能反映了急性神经保护作用而非特异性作用于胶质瘢痕；此外，研究未量化外周免疫细胞浸润、血脑屏障完整性或少突胶质细胞存活情况。未来研究需要进一步分析Col003治疗对免疫细胞浸润、血脑屏障通透性和少突胶质细胞存活的影响。
总之，这项研究表明HSP47抑制剂Col003能通过JAK2/STAT3通路抑制胶质瘢痕形成，改善慢性期缺血性脑卒中的神经功能恢复，为临床治疗提供了潜在的新策略。该研究不仅深化了对胶质瘢痕形成机制的理解，也为开发针对慢性期脑卒中的治疗方法提供了实验依据。
