通过黑豆蛋白水解物介导的代谢重编程增强R. opacus菌中奇数链脂肪酸的生物合成

《Food Bioscience》：Enhancing odd-chain fatty acid biosynthesis in R. opacus via black bean protein hydrolysate-mediated metabolic reprogramming

黑豆蛋白水解物（BBPHs）显著促进Rhodococcus opacus PD630的OCFA合成，其中Neutrase?水解的BBPH-N使OCFA含量达1368.98 mg/L，组学分析揭示丙酰-CoA途径激活及脂质代谢重编程。

　　

刘坤|郑兆军|刘远发

国家食品科学与资源重点实验室，食品科学与技术学院；国家功能性食品工程研究中心；国家谷物发酵工程技术实验室；江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江南大学。中国江苏省无锡市蠡湖路1800号，214122

摘要

尽管Rhodococcus opacus PD630（R. opacus）具有生物燃料、营养和医药应用的潜力，但其生产氧化辛酸（OCFA）的能力受到丙酰辅酶A（propionyl-CoA）可用性的限制。本研究探讨了酶解黑豆蛋白水解物（BBPHs）作为替代氮源对OCFA生物合成的影响。在六种水解物中，用菠萝蛋白酶（bromelain）、风味酶（flavourzym）和Neutrase?酶解的黑豆蛋白水解物显著促进了细胞生长和脂质积累，使OCFA含量增加了3倍，OCFA在总脂肪酸中的比例达到了30.78 ± 0.97%。BBPH-N中的OCFA含量达到了1368.98 ± 157.08 mg/L。代谢组学和脂质组学分析显示，添加BBPH显著提高了细胞内的丙酰辅酶A水平（750.29 ± 45.00 ng/mg，而对照组为476.70 ± 36.71 ng/mg），并调节了琥珀酰辅酶A（succinyl-CoA）的丰度，表明甲基丙二酰辅酶A（methyl malonyl-CoA）途径被激活。共鉴定出69种含有OCFA的甘油三酯和17种甘油二酯，其中TG 54:1（TG 17:0_19:0_18:1）成为BBPH添加组的共同脂质标志物。此外，用Neutrase?酶解的黑豆蛋白水解物还增强了C17系列脂肪酸的积累，并提高了氮的同化效率，这从更高的生物量和上清液蛋白浓度中可以得到体现。总体而言，这些结果表明BBPH可以重新编程R. opacus的碳-氮代谢，促进由丙酰辅酶A衍生的OCFA合成。这项工作展示了一种利用农业工业副产品的绿色且经济可行的微生物脂质生产方法，为循环生物经济战略的发展做出了贡献。

引言

奇数链脂肪酸（OCFAs），包括十五烷酸（C15:0）、十七烷酸（C17:0）和十七烯酸（C17:1），在微生物、植物和动物中以微量存在，但相对于其含量而言，它们具有显著的生理效应（Jenkins, West, & Koulman, 2015）。在人类中，OCFAs已在血浆、红细胞、肝脏、脂肪组织和脑组织中被检测到（Liang, Zhou, Kwame Amakye, Su, & Zhang, 2018）。尽管仅占血浆总脂肪酸的0.13–0.38%，这些分子表现出多种生物活性，包括抗炎、抗菌、抗氧化和免疫调节作用，且没有可检测的细胞毒性（Forouhi et al., 2014; Weitkunat et al., 2021）。流行病学研究进一步表明，OCFAs与心血管疾病、糖尿病和癌症呈负相关，突显了它们作为功能性营养素和预防慢性代谢紊乱的潜在作用（Toral, Hervas, Della Badia, Gervais, & Frutos, 2020）。内源性OCFA的合成与肠道微生物对膳食纤维衍生的丙酸的代谢有关，其系统水平反映了饮食习惯（Dornan, Gunenc, Oomah, & Hosseinian, 2021）。因此，人们越来越关注OCFAs的可持续生产，以用于营养和生物医学应用。

然而，可持续和大规模的生产仍然具有挑战性。产油作物仅能积累微量OCFAs，微生物发酵已成为实现OCFAs大规模生产最有前景的途径。已有多种油性微生物被报道可以合成OCFAs，包括Yarrowia lipolytica、Rhodotorula glutinis（Kolouchova, Schreiberova, Sigler, Masak, & Rezanka, 2015）、Lipomyces starkeyi（Sutanto, Zullaikah, Tran-Nguyen, Ismadji, & Ju, 2018）以及工程改造的Saccharomyces cerevisiae（Qi, Ding, Dong, Wang, & Shi, 2023），但它们的合成效率各不相同。大多数现有策略依赖于复杂的基因工程（Wang, Shi, Lin, Wei, Ledesma-Amaro, & Ji, 2022）或外源丙酸补充（Bhatia et al., 2019），这增加了工艺的复杂性和成本。作为这些策略的替代方案，Rhodococcus opacus作为一种油性放线菌，因其快速生长、GRAS安全性、广泛的底物利用能力和高达干细胞重量60–70%的三酰甘油积累能力（Xu et al., 2022），越来越被认为是微生物脂质生产的理想底盘。值得注意的是，R. opacus能够自然合成偶数链和奇数链脂肪酸，包括C15:0和C17:0，使其特别适合OCFA的生产。

在传统的发酵系统中，氮通常以无机铵盐（Kurosawa, Boccazzi, de Almeida, & Sinskey, 2010）或基于尿素的矿物盐培养基的形式提供，以调节R. opacus PD630中的碳氮比并诱导脂质积累（Chu, Zhang, Lou, Zong, Tang, & Yang, 2019）。虽然这些氮源能有效维持生物量形成和脂质储存，但它们主要作为营养成分，不能主动促进丙酰辅酶A的形成或重新定向代谢流向OCFA生物合成（Wu and San, 2014）。为了提高OCFA的产量，已经提出了增强丙酰辅酶A池、改善丙二酰辅酶A平衡和抑制脂肪酸β-氧化的策略（Zampolli, Orro, Manconi, Ami, Natalello, & Di Gennaro, 2021）。然而，在大多数微生物宿主中，细胞内丙酰辅酶A的供应受到中心碳代谢和氮可用性的严格限制，这是高效OCFA生物合成的主要瓶颈。最近的研究表明，内源性丙酰辅酶A也可以通过氨基酸分解产生，特别是来自支链氨基酸（如缬氨酸和异亮氨酸），实验已证实这可以增强油性微生物中的丙酰辅酶A供应和OCFA积累（Ma et al., 2023）。这些发现表明，氮源的组成而不仅仅是氮的数量，在调节OCFA生物合成中起着关键作用（Qiao, Dong, Xu, Li, & Shi, 2023）。

在这种背景下，植物来源的蛋白水解物已成为传统氮源的可持续替代品。这些水解物来源于低成本和可再生的农业资源，提供了丰富的氨基酸和短肽，它们与中心的碳和氮代谢相互作用，在某些情况下还作为代谢调节剂影响微生物的生产表型（Turki, Kraeim, Weeckers, Thonart, & Kallel, 2009; Taki et al., 2024; Zhang, Yu, & Yang, 2015）。越来越多的证据表明，氮源的组成而非氮的可用性本身，可以重塑细胞内前体供应并重新定向代谢流向高价值的脂质生物合成。黑豆蛋白水解物（BBPHs）来源于丰富且廉价的黑豆资源（Yang, Dias, & de Moura Bell, 2025），是一种特别有前景的OCFA生产氮源。通过提供可能与丙酰辅酶A相关途径相关的复杂氨基酸和短肽混合物，BBPHs提供了克服传统无机和酵母来源氮固有限制的机会。在这项研究中，我们使用油性细菌R. opacus作为微生物底盘，系统地研究了BBPH添加对生长性能、脂质积累和OCFA生产的影响。通过整合脂肪酸分析和代谢分析，我们旨在阐明BBPH介导的氮利用如何重塑细胞内前体供应和代谢流向。这项工作提出了一种成本效益高且可持续的基于氮的策略，以增强微生物OCFA生物合成，并为氮驱动的代谢重编程提供了新的见解。

材料

商业黑豆（Phaseolus vulgaris）来自中国北京的Shiyuedaotian有限公司。蛋白酶的采购情况如下：菠萝蛋白酶（2400 GDU·g^-1）、木瓜蛋白酶（2400 U·mg^-1）和风味酶（100000 U·g^-1）从J&K Scientific有限公司（上海，中国）购买。Alcalase?（2.4 AU·g^-1）和Neutrase?（2500 GDU·g^-1）由诺维信公司（Novozymes A/S，丹麦Bagsv?rd）提供。胰蛋白酶（1000–2000 U·mg^-1）来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。所有酶均

酶解对水解度（DH）的影响

酶解条件直接影响蛋白酶活性，从而决定了水解度（DH）（图1b）。根据先前的研究，选择了2%的酶浓度，并在最佳温度和pH下经过2小时的水解后评估了6种不同蛋白酶的水解度（Yang et al., 2023）。如图1b所示，每种蛋白酶表现出不同的水解特性。其中，风味蛋白酶的水解度最低

结论

本研究通过综合生化和多组学分析，系统阐明了BBPHs如何促进R. opacus中的OCFA生物合成。酶解改变了黑豆蛋白（BBP）的分子量分布和氨基酸组成，产生了富含疏水性和支链氨基酸的肽类氮源，从而支持了细胞生长、蛋白质合成和脂质积累的增强。BBPH添加显著提高了OCFA的产量，其中BBPH-N表现出

作者贡献声明

刘坤：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学，数据分析。郑兆军：项目管理。刘远发：项目管理，概念构思

未引用的参考文献

Héctor et al., 2019; Zhang et al., 2015; Zhao et al., 2023; Zheng et al., 2020.

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家食品科学与资源重点实验室和江南大学（编号SKLF-ZZA-202509）的研究计划的支持