《Food Microbiology》：Assessing the use of acid-based sanitizers for enhancing the microbial safety and quality of collard greens and kale
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本研究针对大型深色绿叶蔬菜（DLGVs）如羽衣甘蓝和甘蓝小包菜因叶片大、表面粗糙易导致微生物污染且清洗效果不佳的问题，系统评估了过氧乙酸（PAA，80 ppm）、食醋（35%）和柠檬汁（13%）在浸泡清洗（5分钟）及后续冷藏储存中对天然微生物群和人工接种的病原体替代菌（Enterococcus faecium）的抗菌效果。结果表明，PAA处理能最有效降低真菌（约1.2–1.4 log）和细菌（约1.0–1.2 log）数量，并在5天冷藏中持续抑制微生物生长，为家庭和零售场景下的DLGVs微生物安全控制提供了实用方案。
在追求健康饮食的今天，深色绿叶蔬菜（Dark Leafy Green Vegetables, DLGVs）如羽衣甘蓝（Collard Greens）和甘蓝（Kale）因其高营养密度和健康促进特性而备受青睐，常被用于制作沙拉、蔬菜汁和冰沙，生食消费量显著增加。然而，这些蔬菜较大的叶片、粗糙的表面纹理以及突出的叶脉和卷曲边缘，形成了复杂的微环境，不仅容易附着微生物，也给清洗消毒带来了巨大挑战。近年来，与DLGVs相关的食源性疾病暴发事件时有发生，例如明尼苏达州曾报告与食用甘蓝相关的沙门氏菌疫情，以及因可能污染单核细胞增生李斯特菌而导致的甘蓝多品牌召回事件，引发了公众对这类蔬菜微生物安全性的高度关注。
通常，消费者和种植者会采用流水冲洗或浸泡的方式来减少新鲜农产品表面的微生物负荷。但在处理大量蔬菜时，清洗过程中的交叉污染风险不容忽视。使用消毒剂进行清洗是防止交叉污染的有效手段。过氧乙酸（Peracetic Acid, PAA）作为一种常见的酸基消毒剂，在工业和家庭实践中广泛应用。同时，食醋（主要成分为乙酸）和柠檬汁（主要成分为柠檬酸）等天然有机酸因其抗菌特性且易于获取，也成为家庭层面有潜力的清洗剂选择。尽管已有大量研究关注生菜、菠菜等叶菜的清洗干预措施，但针对羽衣甘蓝和甘蓝这类大型DLGVs的清洗效果研究仍然有限。此外，考虑到实验室安全，使用非致病性细菌作为病原体的替代物进行评估已成为常见做法。粪肠球菌（Enterococcus faecium）已被证明是评估新鲜农产品上清洗效率时，替代单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌的良好模型。
为了解决上述问题，评估酸基清洗对大型DLGVs微生物安全和品质的保护潜力，研究人员在《Food Microbiology》上发表了一项研究。该研究旨在：1）探究PAA、食醋和柠檬汁清洗对去除或减少羽衣甘蓝和甘蓝表面天然微生物种群及人工接种的粪肠球菌的效果；2）评估清洗后冷藏储存5天内，这些微生物在蔬菜表面的存活情况。
为开展研究，研究人员采用了几个关键技术方法：首先，使用利福平抗性变异的粪肠球菌NRRL B-2354作为病原体替代物进行人工接种，以模拟污染并确保实验室安全。其次，制备了三种酸基清洗溶液：80 ppm的PAA溶液（pH ~4.00）、35%的食醋溶液（pH ~2.75）和13%的柠檬汁溶液（pH ~2.83），并以无菌Milli-Q水作为对照。关键的清洗程序包括将约120克蔬菜叶片完全浸没在6升清洗液中（叶液比1:50，w/v）浸泡5分钟，模拟家庭浸泡操作，随后用100毫升无菌水冲洗15秒以去除残留消毒剂。清洗后的样品部分立即进行微生物分析，其余部分在4°C下冷藏储存5天，并在储存期间的不同时间点（第0、1、3、5天）持续监测微生物数量的变化。微生物分析采用培养依赖的方法，使用特定的培养基分别计数粪肠球菌（TSAR）、总好氧菌（PCA）以及霉菌和酵母菌（DRBC），并使用D/E中和肉汤来终止残留消毒剂的抗菌活性，确保计数准确。所有实验均设置了生物学重复和技术重复，并使用方差分析（ANOVA）进行统计学显著性检验。
3.1. 不同清洗处理对羽衣甘蓝表面天然微生物种群的影响
研究人员首先评估了清洗对羽衣甘蓝表面天然微生物的即时去除效果。结果显示，与仅用水清洗（对照）相比，三种酸基消毒剂均能更有效地减少霉菌、酵母菌和总好氧菌的数量。其中，PAA处理的效果最为显著，分别导致了约1.01 log和1.19 log的减少。在后续5天的冷藏储存中，PAA清洗过的羽衣甘蓝表现出最大的额外微生物减少量，真菌和细菌数量分别进一步减少了约0.96 log和0.81 log。这表明PAA不仅具有强效的即时杀菌能力，还能在储存期间持续抑制微生物的生长。
3.2. 不同清洗处理对甘蓝表面天然微生物种群的影响
在甘蓝上，研究人员观察到了类似的趋势。PAA清洗同样带来了最显著的即时减菌效果，对细菌的减少量达到约1.39 log。有趣的是，在储存期间，柠檬汁清洗的甘蓝表现出最大的额外微生物减少，真菌和细菌数量分别进一步减少了约1.01 log和1.14 log。这说明对于不同的DLGV种类，最佳的后储存抑制效果可能依赖于不同的消毒剂。
3.3. 不同清洗处理后羽衣甘蓝表面粪肠球菌种群的变化
针对作为病原体替代物的粪肠球菌，PAA清洗再次显示出最强的即时灭活效果，减少了约1.52 log。在冷藏储存期间，PAA和柠檬汁清洗的羽衣甘蓝上的粪肠球菌数量持续下降，到第5天时分别出现了约1.48 log和1.58 log的额外减少。这表明酸处理可能对细菌造成了亚致死损伤，使其在后续的不利环境（如低温）中更难存活。
3.4. 不同清洗处理后甘蓝表面粪肠球菌种群的变化
在甘蓝上，PAA对粪肠球菌的即时灭活效果尤为突出，达到了约2.29 log的减少量，显著优于其他处理。在储存期间，所有处理组的粪肠球菌数量均呈下降趋势，其中PAA处理组在5天储存期内又出现了约1.57 log的额外减少，进一步证实了其持续的抗菌潜力。
研究人员对结果进行了深入讨论。他们认为，PAA之所以表现出最强的抗菌效果，是因为它不仅是酸性物质，还是一种强氧化剂，其分子中的过氧基团能够产生活性氧，破坏微生物细胞结构。而食醋和柠檬汁主要依靠其酸性（乙酸和柠檬酸）来使细胞质酸化、破坏质子动力、诱导渗透压应激并抑制大分子合成。研究还指出，DLGVs叶片表面的疏水性以及复杂的微观结构（如气孔大小、密度、蜡质成分）可能影响了清洗剂与微生物的接触效率，从而导致不同蔬菜种类间消毒效果的差异。例如，羽衣甘蓝和甘蓝的表面比生菜更疏水，这可能部分解释了本研究中观察到的减菌效果略低于一些针对生菜的研究。此外，初始微生物负载量、消毒剂浓度、清洗时间、是否搅拌以及储存温度等因素都会影响最终的抗菌效果。酸处理诱导的微生物亚致死损伤，以及清洗后叶片表面微生物群落结构的改变（例如，可能更利于抑制性微生物如假单胞菌属的生长），被认为是导致储存期间微生物数量持续下降的重要原因。
综上所述，本研究系统地评估了酸基消毒剂在提升大型深色绿叶蔬菜微生物安全方面的应用。结果表明，在家庭或小规模零售场景下，采用过氧乙酸（PAA）进行浸泡清洗能最有效地即时降低羽衣甘蓝和甘蓝表面的微生物负载，包括天然菌群和潜在的病原体替代物。同时，PAA和柠檬汁清洗还能在后续的冷藏储存中提供持续的微生物抑制效果。然而，酸洗对蔬菜感官属性（如叶片黄化）和营养品质的潜在影响仍需进一步研究。这项研究为消费者和小型食品经营者提供了基于科学证据的实用清洗指南，对于降低与生食DLGVs相关的食源性风险具有重要意义。
