氩氧低压冷等离子体对悬浮状态及附着在奶酪上的食源性病原体的灭活机制及参数优化

《Food Research International》：Inactivation mechanisms and parameter optimization of argon–oxygen low-pressure cold plasma against foodborne pathogens in suspension and on cheese

本研究量化了Ar/O?低压冷等离子体（LPCP）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌在悬浮液和奶酪表面的杀菌效果。1分钟250W处理使菌落减少对数分别为2.64±0.19、2.45±0.06和2.68±0.16，验证实验显示奶酪表面杀菌对数分别为1.64±0.10、1.17±0.58和1.33±0.25。杀菌机制包括膜破坏（MDA和蛋白泄漏）、光谱分析（脂质和蛋白质信号减弱）及流式细胞术（50%膜损伤细胞）。优化参数为110W、1.7分钟、8%O?，并证实LPCP可有效非热处理杀菌。

　　

徐瑞华|齐格琪|张海|邓浩国|朱军

内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010070，中国

摘要

本研究量化了Ar/O?低压冷等离子体（LPCP）对悬浮液中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌以及奶酪表面的杀菌效果。1分钟的处理（250 W）分别使细菌数量减少了2.64 ± 0.19、2.45 ± 0.06和2.68 ± 0.16 log CFU/ml，不同物种之间没有显著差异。生长曲线显示生长中期延迟，最大密度降低（p < 0.01）。通过丙二醛和蛋白质泄漏的增加证实了细胞膜的破坏（p < 0.01），扫描电子显微镜观察到细胞广泛受损。傅里叶变换红外光谱显示脂质和蛋白质信号丧失，流式细胞术显示单核细胞增生李斯特菌的细胞膜受损程度高达50%。响应面优化（功率110 W，1.7分钟，8% O?）预测金黄色葡萄球菌的细菌数量减少2.47 log CFU/ml；在奶酪上的验证结果显示大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的细菌数量分别减少了1.64 ± 0.10、1.17 ± 0.58和1.33 ± 0.25 log CFU/ml。共聚焦激光扫描显微镜显示1分钟后奶酪的微观结构保持完整，而更长时间的处理会导致脱水裂纹。硫代巴比妥酸反应物质在0.83分钟时没有变化，但在1.67分钟后显著增加（p < 0.05）；2.5分钟后气味和质地的感官评分下降，虽然有轻微的氧化味，但整体可接受性未受影响。Ar/O? LPCP提供了一种快速、非热性的食品表面去污方法，通过破坏细菌膜完整性来提高安全性。

引言

食品表面存在病原微生物是食品工业和公共卫生的主要问题。2020年至2022年间，疾病控制与预防中心和食品药品监督管理局的疫情总结及召回通知中多次提到奶酪问题，其中单核细胞增生李斯特菌是反复出现的危害。这些事件表明，即使是使用巴氏杀菌奶制成的奶酪也可能在巴氏杀菌后加工过程中受到交叉污染。Pra?a等人（2023年）记录了2006年至2020年间欧洲（德国、奥地利、比利时、西班牙和葡萄牙）至少发生了5起与奶酪表面污染相关的多国李斯特菌病爆发，以及73起与奶酪消费相关的金黄色葡萄球菌毒素和8起产志贺毒素的大肠杆菌爆发，这表明奶酪的外皮或涂抹层是单核细胞增生李斯特菌、凝固酶阳性葡萄球菌和致病大肠杆菌生存的关键场所。因此，奶酪表面是非热表面去污技术的理想目标。

冷等离子体技术被认为是一种有前景的非热生物灭活、食品消毒方法，具有环保和高效的特点（Lee等人，2012年）。等离子体中的不同物种具有不同的灭菌机制和应用。当使用含氧气体时，冷等离子体放电会产生丰富的活性氧（ROS），如O^•、O^?、¹O₂、O₃、OH^●和H?O?（Lazzaroni, Baba, Nikravech, & Chabert, 2012）。如果存在氮气，还会产生活性氮物种（RNS），如N^•、N^?、NO^•、NO_x、ONOO^?和HNO?；ROS和RNS都具有强烈的杀菌、杀真菌和杀孢子活性，可用于食品灭菌、农业育种和污染控制（Brun等人，2018年；Lacombe等人，2015年；Laroussi, Kong, Morfill, & Stolz, 2012年；Sun, Zhang, & Wang, 2018年）。

一般来说，冷等离子体可以在大气压或低压下生成。大气压下的冷等离子体源（CAP）是食品加工研究中最常用的系统（Han, Patil, Boehm, and Cullen, 2016年）。例如，Han, Patil, Boehm, and Cullen（2016年）描述了CAP灭活的机制差异，发现对于大肠杆菌，膜泄漏起主导作用，而对于金黄色葡萄球菌，细胞内ROS积累起决定性作用。Song等人（2009年）进一步证明CAP的抗菌效果取决于基质：在相同的功率/时间条件下，切片奶酪比切片火腿能更有效地减少单核细胞增生李斯特菌的数量。此外，Wan, Pankaj, Mosher, and Keener（2019年）将含有Listeria innocua的胰蛋白酶大豆琼脂、奶酪模型和Queso Fresco奶酪暴露于CAP下，表明表面地形是乳制品去污的关键限制因素。Ott, Jochum, Burrough, and Koutchma（2022年）将研究范围扩展到受到单核细胞增生李斯特菌污染的新鲜奶酪，阐明处理时间、奶酪质量和气体流速协同作用调节杀灭效果。然而，CAP生成需要高达1000 V的电压，可能会导致电弧放电，从而损坏或烧伤奶酪表面。

相比之下，低压下更容易生成冷等离子体。低压降低了击穿电压，减少了碰撞和高能电子的产生，同时将中性气体温度保持在25–60°C，产生的均匀辉光含有丰富的离子和活性物种（Oliveira等人，2025年；Ucar, Ceylan, Durmus, Tomar, & Cetinkaya, 2021年）。此外，与CAP相比，低压冷等离子体（LPCP）中的活性物种可以通过选择真空室中的气体类型来有效控制。

文献表明，LPCP在食品加工中表现出显著的微生物灭活能力，能有效减少各种食品表面的细菌和真菌数量（主要是固体食品表面）。据报道，20分钟的氩气和氧气（Ar/O₂）LPCP处理可显著减少新鲜切苹果片上的大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌数量（Segura-Ponce, Reyes, Troncoso-Contreras, & Valenzuela-Tapia, 2018年）。同样，9分钟的Ar LPCP处理可使红辣椒粉中的好氧细菌数量减少0.99 log CFU/g，酵母和霉菌数量减少2.41 log CFU/g（De Silva等人，2024年）。Darvish, Ramezan, Reza Khani, and Kamdari（2022年）使用O₂ LPCP（110 W，30分钟）处理伊朗藏红花，使总微生物、酵母和霉菌数量减少了3.5–4.1 log，并显著改变了其颜色和关键风味化合物。Coutinho等人（2019年）评估了N₂ LPCP对巧克力牛奶饮料的物理化学性质、生物活性化合物和挥发性成分的影响。

尽管许多研究报道了LPCP在微生物灭活方面的潜力，但其机制仍不清楚，其在乳制品中的应用也有限。本研究的目的是探讨Ar/O₂ LPCP对主要食源性病原体（特别是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌）的灭活效果和潜在机制，了解影响该技术效果的因素，并评估其在奶酪表面的细菌去污效果，以供未来食品工业使用。

章节片段

细菌菌株和接种物制备

本研究中使用的单核细胞增生李斯特菌（BNCC 336877）、大肠杆菌（BNCC 336902）和金黄色葡萄球菌（BNCC 186335）购自北京北纳创联生物技术研究所。这些菌株保存在?80°C的无菌甘油溶液中，通过划线平板培养活化。单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌在Brain Heart Infusion（BHI）琼脂培养基上培养。大肠杆菌在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）琼脂培养基上培养。在37°C下过夜培养后

等离子体对不同菌株的影响

在生成等离子体之前，测试了真空条件对三种菌株的灭菌效果，发现活菌数量没有变化，说明真空条件不影响细菌活力，这与Lisovskiy, Yakovin, Yegorenkov, and Terent'Eva（2000年）的结论一致。同时，等离子体石英管的温度基本保持不变。生成等离子体后，研究了Ar/O₂ LPCP的灭活效果

结论

本研究扩展了Ar/O₂ LPCP在食品科学中的应用，阐明了其针对食品源性病原体的灭活机制和关键参数，包括悬浮液和接种在奶酪表面上的情况。然而，考虑到奶酪质量的限制，所取得的减少效果较为有限，优化后的参数需要在商业产品上重新验证。还需要进一步的研究来量化Ar/O₂ LPCP引起的营养和化学变化

CRediT作者贡献声明

徐瑞华：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿构思。齐格琪：方法学，数据管理。张海：资源，方法学。邓浩国：方法学。朱军：撰写 – 审稿与编辑，构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（31860433和62364014）、内蒙古自治区重点研发成果转化项目（2022YFSH0048）和鄂尔多斯市重点研发计划项目（YF20240011）的支持