促进冷等离子体处理诱导的β-乳球蛋白淀粉样纤维的形成：自组装机制、乳化性能及稳定性

《Food Research International》：Promoting the formation of β-lactoglobulin amyloid fibrils induced by cold plasma treatment: self-assembly mechanism, emulsifying properties, and stability

β-LG经冷等离子体（CP）和超声预处理在酸热条件（pH2.0，90℃，10h）下形成纤维蛋白，CP处理显著增强纤维蛋白形成，降低粒径（183.6±4.7nm）并提高乳化活性（51.2m2/g）、稳定性（87.3%）和抗氧化能力，复合葡聚糖后可保护番茄红素免受氧化和胃消化破坏。

　　

宋公帅|赵天|杨英聪|葛阳城|唐伟|向太娇|王丹莉|袁婷兰|李玲|程勇|张梦娜|龚金燕

中国浙江省科学技术大学生物与化学工程学院农产品生物化学加工技术重点实验室，杭州310023

摘要

将β-乳球蛋白（β-LG）转化为淀粉样纤维是一种有效的方法，可以开发出具有增强物理化学性质和功能性的生物材料。本研究探讨了冷等离子体（CP）和超声波预处理对β-LG纤维（β-LGF）在酸热条件（pH 2.0，90°C，10小时）下的影响，并研究了纤维结构与功能性能之间的关系。与对照组相比，CP预处理使ThT荧光强度显著增加了1.9倍，表明纤维形成得到了增强。动态光散射结果显示，CP处理的纤维（P-β-LGF）的平均粒径较小（183.6±4.7纳米），分布更窄（PDI=0.21），而超声波处理和对照组样品的粒径分别为243.1±6.5纳米和278.4±7.8纳米。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和圆二色光谱（CD）证实了从α-螺旋到β-折叠的结构转变，扫描电子显微镜（SEM）图像显示CP处理后的纤维呈延长且均匀分散的状态。从功能性来看，P-β-LGF表现出最高的乳化活性指数（51.2 m2/g）、乳液稳定性指数（87.3%）以及抗氧化活性；由P-β-LGF-葡聚糖复合物稳定的乳液对包裹的番茄红素具有更好的热稳定性和紫外线稳定性。乳液中的番茄红素保留率最高（91.6%）。这些发现表明，CP处理是一种有效、环保且可调的策略，可以调节蛋白质的构象和纤维化动力学，从而增强β-LG的结构和功能特性，为基于蛋白质的生物活性化合物递送系统设计提供了新的见解。

引言

β-乳球蛋白（β-LG）是一种可溶性球状蛋白，单体分子量为18.3 kDa。在大多数哺乳动物的乳汁中，β-LG占总蛋白质或乳清蛋白的比例约为10%或50%（Chelulei Cheison, Brand, Leeb, & Kulozik, 2011; Li et al., 2025; Zhang et al., 2025）。在中性pH下，β-LG以二聚体形式存在，两个单体通过靠近含有游离巯基的半胱氨酸残基的区域相互连接。β-LG的二级结构由一个α-螺旋、三个小螺旋和九个β-折叠组成（Liang et al., 2021; Topuz, Falsafi, Abbasi, Larki, & Rostamabadi, 2025）。小分子（如维生素A和脂肪酸）可以通过β-LG在其疏水核心中作为脂质载体蛋白进行结合和运输（Li et al., 2026; Zhang, Wang, He, Tang, & Liu, 2024）。由于β-LG具有良好的生物相容性和独特的表面活性，它可以有效地作为乳化剂吸附在油滴表面。然而，β-LG刚性的球形结构可能会限制其形成粘弹性界面层的能力，从而影响其在油水界面上的快速重排并降低乳液稳定性（Wu et al., 2025）。因此，修改β-LG的结构以满足食品工业的需求是必要的。

蛋白质纤维化作为一种创新的改性方法，在提高食品蛋白质的功能性方面引起了极大的兴趣。天然蛋白质可以发生变性、水解和自组装，导致β-折叠和“立体拉链”结构的形成，这些结构具有集体有序性、优异的机械性能、丰富的表面官能团和极高的长宽比（Fu et al., 2025; Rostamabadi, Topuz, Rostamabadi, & Jafari, 2025; Tang et al., 2025）。与天然蛋白质相比，蛋白质纤维化产物具有更好的生物相容性和物理化学性质，可用于多种应用场景（如稳定剂、可持续包装和递送载体）。Karabulut（2025）研究表明，蛋白质纤维化可以显著提高蛋白质薄膜的机械性能和屏障性能。Zhang等人（2024）发现，乳清蛋白纤维化产物可以作为稳定剂用于包裹益生菌。在酸性和长时间加热条件下（例如pH 2.0，90°C），可以获得蛋白质纤维。据报道，酸度和加热时间会影响蛋白质的自组装行为，伴随蛋白质内部的构象变化和纤维的形成。酸性环境可以改变蛋白质表面的电荷分布，从而增强分子间的静电吸引力，而高温可以促进蛋白质的热运动和相互作用（Liu et al., 2025）。传统的纤维化过程需要极端的酸性条件和长时间加热，这消耗大量能量和时间。因此，已经采用了多种技术（如核诱导、物理处理和酶处理）来促进蛋白质纤维化，缩短反应时间并控制形态和结构（Yang et al., 2024; Pi et al., 2023; Liu, Yang, Wang, Jiang, & Chen, 2024）。

物理处理方法（如冷等离子体（CP）和超声波）作为一种环保、高效且安全的改性方法受到了广泛关注。CP能够在不使用化学物质或溶剂的情况下有效改性蛋白质（Bayati, Lund, Tiwari, & Poojary, 2024; Hu et al., 2024）。在CP处理过程中，高能电场下会产生活性氧和氮物种（RONS）。水与活性物种相互作用会生成短寿命的活性粒子（如O??、OH?）和长寿命的活性粒子（如O?、H?O?）（Liu et al., 2025; Song et al., 2026）。这些活性粒子可以改变蛋白质结构，增强其物理化学性质和功能。CP处理还可以诱导蛋白质链的结构展开、断裂和肽片段的形成（Tang et al., 2024）。超声波作为一种高效、低成本且环保的处理技术，也可以改变蛋白质结构和功能性质（Liu et al., 2023; Rivera, Angel, Millan, Delgado-Delgado, & Rodríguez-Lazcano, 2025）。超声波空化产生的剧烈碰撞和高局部温度可能导致蛋白质在声波诱导的微气泡的空气-液体界面上不稳定并展开（Fu et al., 2025; Li et al., 2025; Rahman et al., 2025）。Ni等人（2025）证明超声波处理可以改变食品蛋白质的二级和三级结构。然而，不同方法对蛋白质纤维的形态、物理化学和功能性质的影响各不相同。有必要探索CP辅助的酸热处理诱导的β-LG自组装机制，以及结构与功能之间的关系。β-LG纤维（β-LGF）在乳液递送系统中的实际应用面临挑战，主要是在动态应力（如渗透压冲击、剪切和压缩）下的机械脆弱性、胃消化过程中的水解，以及在复杂基质中的功能有限性。研究表明，蛋白质纤维与多糖的复合可以增强乳液的稳定性（Hou et al., 2025）。葡聚糖（Dex）是一种中性多糖，具有优异的溶解性和稳定性，主要来源于谷物，可以清除自由基并促进胃肠道消化。已有研究表明，蛋白质-Dex复合物的乳化和界面性能得到了提升（Zhang et al., 2025）。然而，关于β-LGF与Dex之间的分子相互作用以及该复合物稳定疏水性化合物（如番茄红素）的能力的研究较少。

总之，我们假设通过CP辅助的酸热处理可以形成具有优异物理化学性质和功能的β-LGF，而β-LGF与Dex之间的非共价结合可以增强乳液的稳定性。此外，通过不同方法形成的蛋白质纤维的形态、物理化学和功能性质也有所不同。为了验证这些假设，本研究采用非热处理（CP和超声波）辅助的酸热诱导方法制备了β-LGF，并系统研究了其空间构象、物理化学和功能特性。随后获得了非共价的β-LGF-Dex复合物，并评估了该复合物在模拟胃肠道消化过程中的番茄红素包裹能力。本研究揭示了CP处理在蛋白质纤维化中的应用，以及蛋白质纤维-多糖复合物作为食品工业中疏水性化合物递送载体的潜力。

材料与试剂

β-LG（纯度≥95%，来自牛奶）、Thiaflavin T（ThT）、番茄红素（纯度≥95%）和葡聚糖（分子量70 kDa）由Aladdin生物科技有限公司（中国上海）提供。山茶油（CAO）从当地超市（中国杭州）购买。猪脂肪酶（2500 U/mg）、胰酶（10 U/mg）、胃蛋白酶（2500 U/mg）和猪胰凝乳酶（50 U/mg）由Macklin生化有限公司（中国上海）提供。其他试剂为分析级，由Lingfeng提供。

SDS-PAGE

已有研究表明，大量肽对于淀粉样纤维的形成至关重要（Liu et al., 2024）。SDS-PAGE分析用于探讨β-LG的组成成分，并监测在非热处理辅助的酸热诱导过程中（加热时间0–10小时，间隔2小时）β-LG、U-β-LGF和P-β-LGF的肽谱变化。如图1A所示，随着加热时间的延长，β-LG会水解成更小的肽。

结论

本研究表明，CP预处理通过诱导部分展开和可控氧化有效促进了β-LG在酸热条件下的纤维化。与未经处理或超声波预处理的样品相比，β-LGF表现出更多的β-折叠结构、更高的均匀性和更好的界面活性。当与葡聚糖复合时，β-LGF形成了稳定的界面膜，能够保护番茄红素免受氧化和消化降解。

作者贡献声明

宋公帅：撰写 – 原始草稿。赵天：可视化。杨英聪：软件处理。葛阳城：方法学。唐伟：形式分析。向太娇：监督。王丹莉：数据管理。袁婷兰：方法学。李玲：概念构思。程勇：验证。张梦娜：撰写 – 审稿与编辑。龚金燕：项目管理和资金获取。

伦理批准

本文未涉及人类受试者的研究。所有关于动物使用和护理的指导原则均符合机构、国家和国际标准。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（32302223, 32372469, 32502123, 32502182）、浙江省自然科学基金（LZ24C200006）、浙江省重点科技项目（2024C04020）以及杭州市自然科学基金（项目编号2025SZRJJ2132）的支持。