《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Multiscale analysis on the fibrillation of whey protein isolate induced by cold plasma treatment: regulation mechanism of aggregation morphology and its emulsifying properties
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冷等离子体（CP）辅助酸性热处理可显著促进乳清蛋白 isolate（WPI）纤维化，提升其β-折叠含量（从13.72%增至43.77%）和乳化能力（32.66 m2/g），形成稳定高内相乳胶（HIPEs），并增强包埋番茄红素的保存率和热稳定性。
宋功帅|徐子明|徐震|曾明伟|张梦娜|龚金燕
中国浙江省科学技术大学生物与化学工程学院农产品生物化学加工技术重点实验室，杭州310023
摘要
冷等离子体（CP）处理可以改变蛋白质的结构并修饰其理化性质。然而，在不同纤维化程度下，CP辅助的酸性-热处理导致蛋白质纤维化的机制仍需深入探讨。本研究旨在探讨CP辅助的酸性-热处理对乳清蛋白分离物（WPI）的结构、理化性质及乳化特性的影响，以及其对高内相乳液（HIPEs）的稳定作用。结果表明，CP显著促进了WPI纤维（WFs）的形成，Thioflavin T荧光强度增加了1.84倍，β-折叠片含量从13.72%提高至43.77%。FTIR和SEM分析证实，CP诱导了WPI结构的展开，并形成了高度有序的纤维状聚集体。CP诱导的纤维具有更高的乳化活性指数（32.66 m2/g）和乳液稳定性指数（89.24 min），分别比天然WPI提高了2.1倍和1.8倍。此外，CP诱导的WFs稳定了HIPEs，使其滴粒更小、表观粘度更高、储存稳定性更强。CP辅助自组装纤维化的驱动力主要涉及氢键和静电相互作用。由PWFs稳定的HIPEs显示出更好的番茄红素包封稳定性能。HIPEs中的番茄红素保留率最高（56.10%）。本研究表明，CP辅助的纤维化是一种高效、环保且可控的方法，可用于调控蛋白质的结构和界面功能，揭示了CP在调控蛋白质纤维化过程中的重要作用。
引言
乳清蛋白分离物（WPI）因其高营养价值、优异的生物利用度、良好的消化性和乳化性能，被视为生产增值乳制品的有效成分（Dong等人，2023；Saadi等人，2024；Wu等人，2021）。WPI常作为乳化剂用于食品乳液中，通过空间位阻和静电相互作用在油滴表面形成吸附层，从而提高乳液稳定性。研究表明，WPI及其改性形式（如热变性、糖基化、水解和纤维化产物）可调节脂质的消化和吸收（An等人，2022）。与天然WPI稳定的乳液相比，WPI纤维（WFs）稳定的乳液具有更小的粒径、更高的表面疏水性和更好的抗乳化稳定性（Liu等人，2025）。天然蛋白质可发生变性、水解和自组装，形成丰富的β-折叠片和“空间位阻”结构，从而具备优异的机械性能和丰富的表面官能团（Han等人，2025）。蛋白质纤维具有更好的乳化性能和抗乳化稳定性，这可能归因于其有效降低了界面张力。由于毛细力的作用，纤维具有特定的界面行为（An等人，2022）。采用酸性-热处理方法（例如90°C、pH 2.0、24小时），纤维化过程包括迟滞期、生长期和成熟期三个阶段（Cao & Mezzenga，2019；Tomadoni等人，2020）。根据成核生长理论，迟滞期对于纤维的形成至关重要，此时蛋白质的β-折叠片结构的释放决定了纤维的形成效率（Yang等人，2023）。由于传统酸性-热处理条件极端且水解时间较长，因此需要探索新的方法，以更短的反应时间和更少的能量来控制蛋白质纤维的形态和结构。
冷等离子体（CP）技术作为一种创新的非热处理方法，因其能产生高密度的活性氧和氮物种而受到广泛关注，这些活性物种可在非平衡热力学条件下发挥作用（Deng等人，2025）。活性物种与水或水蒸气反应生成包括单线态氧、激发态氧、原子氧、臭氧等在内的活性物质（Yawut等人，2024）。这些活性粒子通过交联、解聚和氧化作用主要改变蛋白质结构，从而增强其理化性质和功能（Tang等人，2024）。研究表明，CP处理可导致蛋白质结构展开、多肽链断裂和肽片段的形成（Liu等人，2025；Liu & Tang等人，2025）。Han等人（2025）发现，CP辅助的酸热处理形成的玉米醇溶蛋白纤维粒径更小、表面电荷更多。CP处理可导致蛋白质结构展开、多肽链断裂和肽片段的形成，这可能是CP处理对蛋白质纤维化的影响机制。因此，CP在促进WF形成方面具有巨大潜力，有望克服传统酸性-热处理的局限性。研究CP辅助酸性-热处理下WF的结构演变和功能调控机制至关重要。
本研究旨在探讨不同纤维化程度下WF的分子机制及其乳化性能。通过Thioflavin T（ThT）荧光法、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、粒径和Zeta电位测定、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、内在荧光光谱、紫外吸收光谱、表面疏水性、游离巯基和二硫键分析以及乳化和起泡性能，全面表征了WF样品的空间构象和理化特性。进一步分析了结构特性与功能特性之间的关系。此外，还研究了负载番茄红素的WF稳定的HIPEs的稳定性和生物可利用性。本研究有助于深入理解CP处理诱导的WPI纤维化机制和多态性，为开发含有疏水性活性物质的动物蛋白纤维稳定HIPEs提供理论基础。
材料与试剂
乳清蛋白分离物（WPI，蛋白质含量80%，w/w）、Thioflavin T（ThT）、番茄红素（纯度≥95%）和8-氨基-1-萘磺酸（ANS）购自上海Aladdin生物科技有限公司。大豆油（SN）、山茶油（CA）和玉米油（CN）购自当地超市。所有实验使用的超纯去离子水通过Millipore Milli-Q系统（Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德）过滤。其他试剂为分析级，由Lingfeng公司提供。纤维化过程优化
ThT荧光强度可作为判断WPI样品纤维化程度的关键指标。图1A显示了CP处理功率（40–80 W）对WF样品ThT荧光强度的影响。与未经CP处理的WF相比，所有PWF样品的ThT荧光强度均有所增加，表明CP辅助的酸性-热处理增强了WPI的纤维化程度。随着粉末用量的增加，荧光强度也随之增强。结论
本研究证明，CP处理显著加速了WPI的纤维化过程，提高了其结构有序性、界面功能性和乳液稳定性。CP辅助的WPI纤维的ThT荧光强度增加了1.84倍，β-折叠片含量增加了43.77%，乳化能力提高了32.66 m2/g（EAI = 32.66 m2/g，ESI = 89.24 min），从而形成了粒径均匀、高粘弹性的稳定HIPEs。
CRediT作者贡献声明
宋功帅：撰写初稿。
徐子明：方法学设计、实验实施。
徐震：数据分析。
曾明伟：实验监督。
张梦娜：撰写修改。
龚金燕：项目管理和资金申请。
伦理批准
本文未涉及人类受试者相关研究。所有动物使用的管理和护理均遵循了机构、国家和国际相关指南。
未引用的参考文献
Hong, Kong, Chen, Guo and Huang, 2025
Khalifa et al., 2022
Lin, Roos, O'Sullivan and Miao, 2025
Michalska-Ciechanowska, Fiedot, Brzezowska, Turkiewicz and Andlauer, 2025
Ouyang et al., 2023
Pang et al., 2025
Zheng, Gao, Chang, Sun and Fang, 2023
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32302223、32372469、32502123、32502182）、浙江省自然科学基金（项目编号：LZ24C200006）以及浙江省重点科技项目（项目编号：2024C04020）的支持。
