《ACS Chemical Neuroscience》：Solubility and Metastability of the Amyloidogenic Core of Tau
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本研究发现Tau蛋白淀粉样核心片段（tau304–380C322S）在体外溶解度极低（6.1±3.5 nM），通过创新性建立高效液相色谱-紫外/质谱（HPLC-UV/MS）、邻苯二甲醛荧光（OPA）和液体闪烁计数（LSC）三种检测方法，揭示了该片段强烈的纤维化热力学驱动力与高成核能垒共存的独特性质。这项工作为理解tau蛋白病理聚集的物理化学基础提供了关键参数，对阿尔茨海默病（AD）等tau蛋白病的治疗策略开发具有重要启示。
溶解度与亚稳定性：Tau蛋白淀粉样核心片段的物理化学特性
引言
蛋白质的自组装及其后续淀粉样纤维沉积物的积累与多种疾病密切相关，并影响人体的各个器官。在大脑中，淀粉样β肽（Aβ）和tau蛋白的沉积物构成了在阿尔茨海默病（AD）中最常见的痴呆形式中观察到的特征性斑块和神经原纤维缠结。该疾病给个人带来巨大的痛苦，社会负担也十分沉重。tau蛋白聚集物的积累和沉积也是其他几种神经退行性疾病的共同特征，这些疾病被统称为tau蛋白病。tau蛋白淀粉样积累参与神经退行性疾病的过程，要求对其聚集的所有方面进行物理化学表征，包括其平衡和动力学。
由于重组全长tau蛋白的高表观溶解度及其在体外明显的高聚集势垒，可以引入额外的化学添加剂或表面来诱导聚集。许多已被证明能够触发tau蛋白聚集的分子是多阴离子，如肝素和RNA，或带负电荷的脂肪酸。通过冷冻透射电镜（cryo-TEM）进行的结构解析表明，在肝素存在下形成的tau蛋白纤维呈现出与在AD或其他tau蛋白病患者大脑中发现的tau蛋白纤维不同的形态。缺乏可靠的无外部诱导剂的tau蛋白聚集研究模型系统阻碍了该领域的发展。为此，我们先前开发了一种tau蛋白片段的表达和纯化方案，该片段涵盖了来自AD大脑的离体tau蛋白纤维的淀粉样核心区域。该片段包含根据2N4R（也称为tau441）编号的氨基酸残基304–380，并在无外部诱导剂的低离子强度缓冲溶液中形成纤维。将半胱氨酸322突变为丝氨酸，使该片段能够在非还原条件下进行研究，而不会形成人工二聚体。因此，本研究采用了相同的片段，tau304–380C322S，本文中称为tau或tau AD核心片段。
我们最近开发了一种经济实惠的高通量蛋白质溶解度测定方法。在当前的工作中，我们展示了该测定在tau AD核心片段上的应用，并进一步开发了使用放射性标记肽的额外定量策略，从而能够在更复杂的样品基质中进行定量。此外，我们引入了一种HPLC-UV/MS方法用于定量和区分修饰肽与原始起始材料。
结果与讨论
首先，我们提出了一种测定tau AD核心片段溶解度的方法，使用离心作为分离方法，HPLC-UV吸光度用于定量，质谱（MS）用于鉴定。然后，我们研究并讨论了方法学和定量技术的选择如何影响结果。
测量淀粉样肽的溶解度存在若干困难。我们已经确定了需要克服的三个主要障碍，并展示了不同方法学的优缺点。
（I）能否以可重复的方式达到平衡状态？在聚集过程中保持均匀分散非常重要。如果纤维从溶液中沉降出来，这些纤维催化进一步聚集的能力相较于纤维和单体在每个样品部分以相同比例共存的分散状态要弱。在纤维沉降的情况下，亚稳态将由初级成核能垒维持，该能垒远高于延伸和次级成核能垒。此外，我们观察到肽在长时间孵育期间其一级结构发生变化，例如化学修饰和/或截断。这是在37°C长时间孵育未折叠蛋白质溶液时的常见现象，并已在有限蛋白水解中经典地用于确定蛋白质结构域的组织。因此，为了保持肽的完整性以进行可靠的溶解度测量，有必要在合理的实验室时间范围内达到单体和纤维之间的平衡，以避免肽的降解。在这里，我们使用磁力搅拌子搅拌以保持纤维分散，从而显著加速聚集过程。搅拌在纤维形成过程中的重要性以及tau在静止条件下显著的亚稳定性在支持信息（SI）中进行了进一步探讨。有趣的是，我们观察到，与一直静止或一直搅拌的样品相比，在最初静止然后搅拌的样品中，通过HPLC分析时，降解成具有不同保留时间的更 distinct 的物种。这可能是由纤维表面催化化学反应所解释的，这种现象在其他淀粉样肽中已有报道。
（II）能否有效地将单体与纤维分离？在检测样品中所有蛋白质的方法中，去除纤维对于定量单体浓度是必要的。本工作中使用的所有技术都基于一个分离步骤，因此其性能是一个需要研究的重要因素。在这里，我们使用了过滤和离心两种方法，并评估了两种方法的优缺点。
（III）能否可靠地定量肽的浓度？根据样品复杂性、目标浓度和特定系统中可用于检测的信号参数，各种技术可能或多或少适用。Tau的溶解度在纳摩尔范围内，这大大减少了可能技术的数量。我们在此证明，使用反相色谱与质谱联用的分析型HPLC结合UV吸光度检测，是一种可靠的方法，可以定量溶液中如此低浓度的tau肽，并区分肽变体（修饰和/或截断）和杂质。我们将此方法与使用邻苯二甲醛荧光（OPA）和液体闪烁计数（LSC）的定量方法进行比较，前者快速、简单且经济实惠，但与HPLC-UV相比缺乏选择性和灵敏度，后者是用于具有更高组分复杂性的样品的选项，并依赖于tau AD核心片段的放射性同位素标记。
Tau的溶解度
通过检查tau AD核心片段在聚集过程中溶液中的浓度来研究其溶解度，起始于两个单体浓度（5和10 μM）的超饱和溶液并接近平衡。通过离心将单体与纤维分离，并通过HPLC-UV吸光度定量上清液中的tau浓度。使用HPLC-MS，在3.6分钟处的A280和A205峰被鉴定为完整的tau。当在聚集过程的不同时间点积分该峰的面积时，发现游离单体浓度在16小时后达到平台期，为6.1 ± 3.5 nM（n = 10），与向溶解度极限收敛一致。平衡时游离单体的浓度变得恒定，因为溶液中和纤维相中的单体的化学势相等，从而产生确定的溶解度极限。我们将这个平台称为表观溶解度，因为实验测量无法区分系统是达到了真正的热力学平衡还是保持在亚稳态（动力学陷阱）状态。另一个挑战出现在存在化学修饰或降解的tau物种时，如果它们与完整肽形成共聚集体或者它们自身具有不同的溶解度，它们可能会改变测量的单体浓度。色谱图中的另一个峰，即在~3.3分钟处洗脱的物种，从一开始就存在于所有样品中。该物种似乎没有被纳入纤维中，而是在达到平衡后仍留在溶液中。它代表了一个小但可检测的痕量污染物，其峰面积（UV205）小于初始单体峰的1/1000。该峰在280 nm处没有吸光度，在质谱图中也没有显著的质量。因此，我们得出结论，该峰代表一个微小的污染物（<0.1%），不应在tau纤维形成的背景下进行分析。
当处理纳摩尔浓度范围的蛋白质时，考虑在样品制备和定量过程中由于吸附到表面（如样品管和仪器管路）而可能造成的非故意蛋白质损失非常重要。作为对照，将已知浓度的样品直接注入HPLC仪器或首先接触所有实验表面，如微量离心管和96孔板。基于这些对照实验，我们得出结论，与稀释误差相比，由于吸附造成的蛋白质损失可以忽略不计，从而验证了6.1 ± 3.5 nM作为当前条件下tau溶解度的度量。
分离方法：过滤与离心
通过分别定量滤液或上清液中剩余的物种，检查了过滤和离心分离单体与纤维的效果。剩余单体的定量通过与伯胺反应染料OPA的衍生化完成。同时，在另一个补充了10 μM硫黄素T（ThT）的反应混合物中监测生长的纤维部分，起始于10 μM单体，在每个时间点取出50 μL后测量荧光强度（F.I）（激发448-发射480）。为了排除单体损失到过滤器上的可能性，将一定浓度范围内的tau单体进行OPA衍生化，无论是否经过过滤。观察到可忽略的单体吸附。然而，来自过滤器的痕量污染物贡献了最小的荧光背景。为了研究这种背景对最终溶解度测量的潜在影响，将已知浓度处于标准曲线低端的样品与OPA反应，无论是否经过过滤。对纯缓冲液也进行了相同的操作。发现过滤样品引入的微小但可检测的背景小于实验方法的标准偏差。为了进一步研究过滤作为分离单体与纤维的有效策略，在淀粉样反应性刚果红衍生物X34存在下，测量了tau纤维的荧光强度，在过滤前后。过滤器有效地去除了所有结合X34的物种，在滤液中检测到可忽略的X34荧光强度，表明纤维已从溶液中有效去除。总之，过滤和离心都能有效地将单体与纤维分离，产生可比的溶解度测量结果。
定量方法比较：HPLC、OPA-荧光和LSC
在确定了HPLC可以区分完整tau和肽的修饰变体之后，我们现在询问使用OPA的更粗略的定量策略是否足以确定悬浮液中物种的总浓度。此外，为了在具有高组分复杂性的样品中定量低浓度，而不使用荧光探针干扰系统或使用HPLC分离，液体闪烁计数（LSC）是一个选项。为了将后一种技术与HPLC和OPA荧光进行比较，通过在最小培养基中表达tau，并在诱导蛋白质表达前加入氚标记的葡萄糖，对tau进行放射性标记。将10 μM单体的溶液在37°C搅拌孵育，并在聚集过程中取出部分样品，进行过滤并使用LSC定量。tau浓度使用标准曲线获得，如支持信息中所述。所得浓度如图所示，以便与HPLC和OPA作为定量技术进行比较。
需要注意的是，从标准曲线可以看出，通过OPA荧光和LSC获得的浓度都接近其定量限，它们之间的两倍差异可归因于此。在表达过程中使用放射性更强的同位素或更大量的氚标记葡萄糖可能会改善检测限。在比较不同定量方法获得的值时，另一个重要方面是，OPA荧光和LSC分别定量总蛋白质或总tau，因此，它们反映了溶液中所有物种的 combined 浓度。相比之下，HPLC分离物种并对单个峰积分提供离散的浓度估计。因此，应将HPLC色谱图中所有积分相加得到的浓度与其他技术获得的值进行比较。当对支持信息中的色谱图在340小时进行这种比较时，总和为128 nM，这使得不同的定量策略彼此之间具有良好的一致性。
结论
本工作扩展了我们之前的淀粉样蛋白溶解度测定方法，引入了通过HPLC-UV/MS进行定量和鉴定的新方法，灵敏度达到低纳摩尔范围。我们还引入了一种策略，使用LSC能够在更复杂的样品基质（如血液或脑脊液）中进行定量。尽管这种方法依赖于肽的放射性标记，但在此类情况下，它可能为获取体内溶解度信息提供一种选择。接下来，我们在tau上验证了我们之前开发的OPA测定法，确认其作为一种快速、经济实惠但选择性较差的方法的用途。
对于具有高成核能垒的系统，如tau，我们证明受控搅拌能有效缩短处于亚稳态的时间。通过加速纤维形成，这种方法使得在实验室时间范围内达到平衡成为可能，从而可以研究其他具有挑战性的系统的溶解度。本工作中采用的定量策略都依赖于测量溶液中游离单体的浓度，这需要一个有效的分离步骤来去除纤维。我们比较了过滤和离心，发现两种方法在我们的系统中都能有效地实现这一点，产生一致的溶解度值。使用这些方法，我们确定tau淀粉样核心片段在我们实验条件下的溶解度约为6 ± 3.5 nM。这将当前的tau片段置于已报道的淀粉样蛋白溶解度的低端，显著低于Aβ40和α-突触核蛋白，更接近Aβ42的低纳摩尔范围。这强调了tau纤维形成的强大热力学驱动力。同时，其在体外的聚集以长滞后期为特征，表明存在高成核能垒。这种强大的热力学驱动力和高动力学能垒的结合表明，该序列可能已经进化出内部动力学保护机制来抵抗自发聚集。我们可以推测其在疾病中的潜在意义，可以想象，翻译后修饰，如磷酸化，可能会损害这种保护机制。修饰可以在纤维形成之前或之后发生，并通过降低成核能垒或产生具有极低溶解度或高种子能力的物种来使平衡向聚集方向移动。tau截断产物在所谓的幽灵缠结中非常丰富，这些缠结在含有它们的神经元死亡后仍持续存在于AD患者的大脑中。我们的结果表明，此类截断片段可能继承本研究中核心片段的极端不溶性，同时绕过全长tau的动力学保护。短tau物种的积累创造了一个蛋白质稳态死胡同，细胞清除机制无法有效地溶解或降解它们。理解溶解度、亚稳定性和蛋白水解之间的平衡可能是未来针对tau蛋白病的治疗策略的关键。
方法与材料
表达与纯化
Tau304–380C322S按照先前描述的方法进行表达和纯化。发现初始的甲硫氨酸在大肠杆菌中被去除，因此未列在序列中。简而言之，密码子针对大肠杆菌表达进行了优化，并克隆到Pet3a质粒中。将质粒转化到大肠杆菌（BL21 Star DE3 pLysS）中。通过自动诱导培养基实现过表达。tau片段的同位素富集是在最小M9培养基中实现的，其中葡萄糖补充了氚标记的d-葡萄糖作为主要碳源。在最小培养基中，用IPTG诱导过表达，氚标记的d-葡萄糖在IPTG前5分钟加入。通过煮沸收获并超声破碎细胞后的上清液进行纯化。煮沸后，通过离心去除沉淀的内源蛋白，剩余的可溶部分通过一系列离子交换和尺寸排阻色谱步骤进一步纯化。
蛋白质在-20°C下冻干保存，每次实验前，在脱气和过滤的实验缓冲液中，通过Superdex75 10/300柱进行最终的尺寸排阻色谱步骤。这样做是为了确保起始材料是单体和超纯的蛋白质。在280 nm监测吸光度，并通过积分色谱图和使用理论消光系数1490 M–1cm–1（通过Expasy protparam使用氨基酸序列估算）计算蛋白质浓度。
溶解度孵育以及可溶与不可溶物种的分离
将新鲜分离的tau单体稀释，以便从多个浓度达到表观溶解度。稀释后，将单体溶液在5 mL蛋白质低结合管中孵育以形成纤维，使用聚四氟乙烯包覆的磁力搅拌子（200 rpm）进行搅拌。样品在37°C孵育，使过饱和单体形成纤维并达到表观平衡。孵育后，通过离心过滤使用具有0.2 μm孔径GHP膜的acroprep 96孔滤板（在HPLC数据中为2000 xg 2分钟或20000 xg 30分钟）或在空气驱动超速离心机中超速离心（100,000 xg 1小时）将单体与纤维分离。
通过邻苯二甲醛荧光定量单体
过滤或离心后，将50 μL单体滤液或上清液与5 μL伯胺反应染料邻苯二甲醛（OPA）衍生化，并在室温下孵育10分钟。反应在黑色底96孔板中进行。使用激发波长340 nm（狭缝30 nm）和发射波长440 nm（狭缝40 nm），二向色镜设置在387.5 nm，在酶标仪中测量荧光强度，增益和焦距高度自动调整。未知样品的浓度使用从至少六个tau单体标准溶液（从分离单体时已知浓度计算的FPLC色谱图积分进行系列稀释）获得的荧光信号进行未加权线性回归得到的方程计算。
通过HPLC-UV定量单体
对于通过HPLC-UV进行的单体定量，将30 μL样品注入CN反相柱，使用岛津Nexera X3系统连接单四极杆质谱仪用于峰鉴定；柱温保持在60°C，样品使用从5%到95%乙腈的线性梯度在10分钟内洗脱，水相流动相含0.1% TFA，流速0.5 mL/min。UV信号在205和280 nm同时采集，使用SPD-40 V检测器，操作频率10 Hz，“标准”响应，池温40°C。
纤维浓度随时间的变化
在存在10 μM ThT的情况下，在5 mL管中通过搅拌跟踪纤维质量。在每个时间点，取50 μL纤维溶液，在酶标仪中测量荧光强度，激发448 nm，发射480 nm。
通过液体闪烁计数定量单体
溶解度孵育如上所述进行，但使用3H标记的tau。使样品在37°C达到表观平衡，然后通过过滤或超速离心将可溶物种与纤维分离。将20 μL滤液与3 mL Ultima Gold LLT闪烁液混合，在Hidex 600 SL中计数10分钟。浓度使用从已知浓度标准曲线获得的每分钟计数进行线性回归计算。
质谱分析
MALDI-MS
对于基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）分析，将每种蛋白质样品（“静止”、“搅拌”和“储备”）的1 μL用2 μL 0.1%三氟乙酸（TFA）稀释，然后将1 μL此稀释的蛋白质溶液与0.5 μL基质溶液（由5 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸、80%乙腈、0.1% TFA组成）混合，并加入到MALDI不锈钢靶板上。使用Autoflex Speed MALDI TOF/TOF质谱仪在正离子反射器和线性模式下采集MS和MS/MS谱图。所有谱图均使用肽校准标准II（反射器模式）和蛋白质校准标准I（线性模式）进行外部校准。
通过MS进行HPLC-UV中的峰鉴定
为了鉴定HPLC-UV运行中哪个峰对应于完整的tau片段，连接的四极杆（LCMS-2020，岛津）在扫描模式下运行。在3.6分钟的吸光度峰期间，检测到的8个最突出的m/z峰与tau304–380C322S理论分子量（8379.4 Da）的不同电荷态一致。质谱仪在ESI+模式下运行，接口温度350°C，DL温度250°C，加热块温度200°C，雾化气体N21.5 L/min，干燥气体N215 L/min，接口电压4.5 kV。
LC-MS/MS
对于LC-MS/MS分析，所有三个蛋白质样品均通过添加测序级修饰胰蛋白酶进行消化，蛋白酶与蛋白质的比例约为1:50，并在37°C孵育4小时。然后再次添加胰蛋白酶，最终蛋白酶与蛋白质的比例约为1:25，样品在37°C孵育过夜。第二天，加入甲酸（FA）至终浓度为0.5%。肽段通过C18反相微柱进行清理，使用2%乙腈（ACN）、0.1% FA平衡缓冲液和80% ACN、0.1% FA洗脱缓冲液。收集的肽样品在通风橱中干燥，并重悬于15 μL 2% ACN、0.1% FA中，然后进行高分辨率MS分析。肽样品通过LC-MS/MS进行分析，将其注入超高压纳流色谱系统。肽段上样到Acclaim PepMap C18 trap柱上，并在Bruker Pepsep Ten C18分析柱上分离。使用流动相A（2% ACN, 0.1% FA）和流动相B（0.1% FA in ACN）进行45分钟的梯度洗脱（20分钟内从2%到17% B，10分钟内从17%到34% B，3分钟内从34%到95% B，在95% B保持12分钟），流速400 nL/min，柱温箱温度50°C。肽段在四极杆飞行时间质谱仪上通过纳升电喷雾离子源在正离子模式下进行分析，由OtofControl 5.1软件控制。离子传输毛细管温度为180°C。使用DDA方法选择前体离子进行碎裂，进行一次TIMS-MS扫描和10次PASEF MS/MS扫描。TIMS-MS扫描在0.60–1.6 V s/cm2和100–1700 m/z之间采集，斜坡时间为100 ms。10次PASEF扫描每次最多包含10次MS/MS扫描，碰撞能量为10 eV。使用最多5个电荷的前体离子，强度阈值为5000 au，动态排除时间为0.4秒。LC-MS/MS的原始数据使用Mascot Distiller处理，并使用Mascot Daemon针对包含tau304–380C322S片段序列的内部数据库进行搜索，设置如下；前体离子容差：10 ppm，MS/MS碎片质量容差：0.015 Da，蛋白酶：无，可变修饰：乙酰化（蛋白质N端），脱酰胺化（NQ），和氧化（M）。当使用“无”作为蛋白酶设置时，Mascot将在没有任何酶切特异性的情况下搜索每个蛋白质序列，而不仅仅是寻找在精氨酸和赖氨酸后切开的胰蛋白酶肽。如果tau片段在任何其他氨基酸处被切割，这将在此数据库搜索中显示。如果单个离子得分大于34（p < 0.005）且肽在数据集中至少被识别两次，则认为肽被识别。
