《ACS Central Science》：Directed Evolution of Enzymes for Bioorthogonal Chemistry Using Acid Chloride Proximity Labeling
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本文报道了DEEPMACh平台——一种将酵母表面展示与掩蔽酰氯探针相结合的超高通量酶定向进化策略。该研究创新性地开发了苯基环丙基（pCP）这一高生物正交性保护基，并成功进化出对pCP水解活性提升232倍的BS2酯酶变体（BS2-TRFLE）。通过pCP/BS2-TRFLE系统在哺乳动物细胞中实现空间特异性RNA标记及转录组测绘，为活细胞精准操控提供新工具，推动成像、靶向治疗等领域发展。
开发DEEPMACh平台实现酶的超高通量定向进化
研究团队构建了名为DEEPMACh（通过掩蔽酸氯探针定向进化酶）的新平台，其核心是将酵母表面展示技术与邻近标记化学相结合。该平台利用表达酶变体的酵母细胞库与掩蔽酸氯探针（如AC-2或SP-d5）共孵育，活性酯酶可水解探针的酯键，释放高反应性酸氯中间体，后者迅速与酵母表面亲核基团共价结合，进而通过点击化学连接荧光标签实现流式细胞分选（FACS）。此策略可在单次实验中筛选超过107个突变体，且通过精确控制反应时间（短至5秒）与底物浓度实现高强度筛选。
苯基环丙基（pCP）保护基展现卓越生物正交性
相较于既往使用的1-甲基环丙基（mCP）保护基，新设计的pCP保护基在多种哺乳动物细胞系（如HeLa、HEK293T、MDA-MB-231等）中背景水解活性显著降低（6–30倍）。实验表明，pCP保护的荧光素（pCP-FL）在10%胎牛血清中的稳定性比mCP-FL提高50–100倍，且在细胞裂解液中具有更高抗水解能力。pCP保护的酸氯探针（pAC-2）在TNBC细胞中背景标记信号远低于mCP探针（AC-2），证实其优越的生物正交性。
BS2酯酶的定向进化获得高效pCP水解变体
野生型BS2酯酶（BS2WT</sup）对pCP底物活性极低，研究通过两轮进化获得关键变体：
- 1.
第一轮进化（以mCP探针AC-2筛选）：获得BS2-LTE（突变M220L/A328T/K481E），其对pCP活性意外提升8.6倍；
- 2.
第二轮进化（以pCP探针SP-d5筛选）：从BS2-LTE库中筛选出BS2-TRFLE（新增Q271R/L361F）和BS2-ELLVAT（新增P287L/D319A/I470V）。酶动力学分析显示，BS2-TRFLE对pCP-香豆素的cat/KM较野生型提升232倍，且对mCP底物活性保持1.6倍增强。结构模拟表明，突变导致活性中心疏水空腔扩张（如I269上移约2 ?），L361F突变可能与pCP苯环形成π-堆积作用，促进大体积底物结合。
进化酶在哺乳动物细胞中实现精准空间标记
将BS2-TRFLE定位至细胞核、线粒体、核仁等区室后，pAC-2探针处理5分钟即可产生酶依赖性的标记信号，且与酶表达位置高度共定位。在TNBC细胞中，BS2-TRFLE/pAC-2系统的RNA标记效率优于APEX2-生物素苯酚体系，并成功用于亚细胞转录组分析：
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线粒体定位：显著富集线粒体编码转录本（如mt-mRNAs、mt-rRNAs）；
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细胞核定位：富集1664个核特异性转录本，包括Malat1、Neat1等长链非编码RNA（lncRNA）；
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背景控制：pAC-2探针的非特异性标记转录本数量（1.7%）显著低于AC-2探针（3.6%）。
技术平台拓展生物正交操控应用场景
DEEPMACh平台突破了天然酶库的限制，实现了“定制保护基-定制酶”的精准匹配。pCP/BS2-TRFLE系统为活细胞中时空分辨的分子解锁提供了新工具，有望应用于靶向药物释放、成像探针激活及亚细胞转录动力学研究。未来该策略可扩展至其他水解酶或非水解酶类，进一步丰富生物正交化学工具箱。
