《Plant Biotechnology Journal》：SBP-Box Transcription Factor JcSPL9 Regulates Both Seed Yield and Oil Content in the Biofuel Plant Jatropha curcas
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本文揭示了SBP-box转录因子SPL9在生物燃料植物麻风树（Jatropha curcas）中的关键作用。研究发现，过表达对miR156具有抗性的JcSPL9（rJcSPL9）能显著增加种子产量（最高提升80.76%）和含油量（提升12.6%），同时改变脂肪酸组成，提升生物柴油氧化稳定性（OS）。相反，过表达JcmiR156a则产生相反效应。该研究首次证实miR156/SPL模块调控种子脂质积累和脂肪酸生物合成，为油料作物遗传改良提供了新靶点。
ABSTRACT
麻风树（Jatropha curcas）是一种重要的生物柴油和生物航空燃料原料作物，但其种子产量受限于有限的花序数量。SPL9是SBP-box基因家族成员，促进植物从幼年期向成年期转变。积累的证据表明，miR156/SPL模块在调控多种植物发育过程中起重要作用。本研究揭示了JcSPL9同时调控麻风树的种子产量和含油量。JcSPL9在果实中高表达，并随树龄增长而上调。过表达miR156抗性JcSPL9（rJcSPL9）显著增加了种子产量和含油量，而过表达JcmiR156a则产生相反效果。rJcSPL9转基因植株的最高种子产量比野生型（WT）增加80.76%，同时种子含油量增加12.6%。相应地，JcmiR156a转基因植株的种子产量降低51.67%，种子含油量降低8.28%。此外，在rJcSPL9和JcmiR156a转基因麻风树和拟南芥以及拟南芥spl9突变体中，种子油脂肪酸组成均发生显著改变。关键油脂生物合成基因，包括JcWRI1、JcDGAT1、JcDGAT2和JcOLEOSIN，在rJcSPL9转基因种子中上调，而在JcmiR156a转化体中下调。该研究首次提供了miR156/SPL9模块调控种子脂质积累和脂肪酸生物合成的证据，突出了SPL9作为提高麻风树及其他油料作物产油量和品质的有前景靶标。
Abbreviations
文中列出了研究涉及的主要缩写词，包括AP1（APETALA1）、AP2（APETALA2）、CaMV（cauliflower mosaic virus）、DU（degree of unsaturation，不饱和度）、FA（fatty acid，脂肪酸）、FT（FLOWERING LOCUS T）、FUL（FRUITFULL）、IPA1（IDEAL PLANT ARCHITECTURE 1）、KRN（KERNEL ROW NUMBER）、LD（long-day conditions，长日照条件）、LFY（LEAFY）、OS（oxidative stability，氧化稳定性）、qRT-PCR（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，实时定量逆转录聚合酶链式反应）、SBP（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN）、SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1）、SPL（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE）、tsh4（tasselsheath4）、UB3（Unbranched3）、WAP（week-after-pollination，授粉后周数）、WFP（WEALTHY FARMER'S PANICLE）。
1 Introduction
随着化石燃料减少和环境污染加剧，生物柴油作为替代燃料备受关注。利用玉米、水稻、大豆等粮食作物生产生物燃料会引发粮食安全问题。在边际土地上种植能源植物是潜在解决方案之一。麻风树是一种多年生木本植物，具有高含油量、高生物量、适应性强、不与粮食竞争等优点，但其种子产量低限制了其潜力。麻风树营养生长旺盛，但开花和分枝不良是导致低产的重要因素。已有一些策略被报道用于提高麻风树种子产量。
在植物王国，microRNA（miR）156和miR172在营养生长向生殖生长转变中起关键调控作用。miR172的转录受到SPL9和SPL10的正向调控，而SPL是miR156的直接靶标，因此SPL参与miR156和miR172信号级联。在拟南芥中，miR156在早期茎尖发育中高表达，随发育进程而降低，而SPL9则呈现相反的时间表达模式。在木本植物中也观察到类似模式。SPL家族成员影响幼年期向成年期转变。拟南芥中有16个SPL家族成员。过表达miR156会下调AtSPL基因，延长幼年期。组成型过表达不同AtSPL会加速阶段转变，其中AtSPL9、AtSPL13和AtSPL15作用更为重要。AtSPL9直接激活miR172b表达，通过抑制APETALA2（AP2）蛋白促进开花，AP2也参与种子相关表型，如种子重量、产量和油脂生物合成。AtSPL9还参与调控株型、胁迫响应等过程。在水稻中，过表达SPL9同源基因OsSPL14（也称IPA1或WFP）可增加穗分枝和粒重。在玉米中，UB3是OsSPL14的同源基因，负向调控花序分生组织大小。适度表达UB3可抑制分蘖但促进穗分枝，增加每穗粒数。小麦TaSPL14也调控穗发育和千粒重。大豆中四个GmSPL9基因冗余调控株型。
麻风树营养生长旺盛但生殖生长相对较弱，种子产量低。已鉴定出15个JcSPL基因，但仅JcSPL3在拟南芥中异位表达。系统发育分析显示JcSPL9形成一个独立分支。因此，作为AtSPL9同源基因的JcSPL9可能在促进麻风树生殖生长中起重要作用。本研究克隆了JcSPL9并分析其在麻风树生长发育中的作用，证明JcSPL9调控种子产量和含油量，并首次提供证据表明miR156/SPL模块在调控种子脂肪酸生物合成和脂质积累中发挥作用。
2 Materials and Methods
2.1 植物材料与生长条件
麻风树不同组织样品采自中国科学院西双版纳热带植物园（XTBG）。转基因麻风树幼株在温室培养，成株于2018-2024年定植于XTBG田间。T1代转基因麻风树于2020年8月萌发，11月移栽田间。用于qRT-PCR的组织样品液氮速冻后-80°C保存。分析了T0和T1代麻风树表型，每种基因型超过25株。拟南芥spl9-4突变体和spl9-4 spl15-1双突变体种子购自TAIR网站。野生型、突变体和转基因拟南芥在1/2 MS培养基萌发一周后移栽至草炭土，在22°C ± 2°C、长日照（LD，16小时光照/8小时黑暗）条件下培养。每种拟南芥基因型超过50株用于收种。
2.2 miR156抗性JcSPL9（rJcSPL9）cDNA的克隆
从麻风树幼叶提取总RNA，反转录合成第一链cDNA。根据麻风树基因组数据库（ID: Jcr4S01955.50或XM_012232354）预测的JcSPL9 cDNA序列设计克隆引物。通过重叠PCR引入同义突变，获得miR156靶位点突变的rJcSPL9全长序列。JcmiR156a以基因组DNA为模板PCR扩增。PCR产物克隆至pGEM-T载体测序。
2.3 过表达载体构建与植物转化
将rJcSPL9和JcmiR156a全长cDNA序列酶切后连接至含CaMV 35S启动子的pOCA30载体，构建35S:rJcSPL9和35S:JcmiR156a植物过表达载体。利用农杆菌EHA105菌株介导转化麻风树。通过农杆菌介导的花序浸染法获得转基因拟南芥。通过人工授粉获得杂交株系。通过基因组PCR和RT-PCR验证转基因植株。
2.4 实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析
提取麻风树组织总RNA，使用PrimeScript RT试剂盒合成第一链cDNA。稀释cDNA模板后，使用SYBR Premix Ex Taq II在Roche 480实时PCR系统上进行qRT-PCR。使用2?ΔΔCT方法分析数据，以JcActin1基因作为内参归一化特定基因转录水平。
2.5 花、果实和种子表型分析
使用Leica DFC425相机和Leica DM IRB解剖镜观察并拍摄花和果实解剖结构。使用电子游标卡尺测量果实和种子的长、宽、高，使用电子天平称量种子重量。使用Leica软件分析功能测量拟南芥种子长宽。
2.6 茎秆成分分析
收获温室培养的两个月大T1代转基因麻风树幼苗，测量其中部茎秆直径。茎秆用5%高锰酸钾溶液（KMnO4）和5%红墨水染色后，测量韧皮部、木质部和髓的厚度并计算各自面积。
2.7 索氏提取法测定种子含油量
根据AOAC方法920.85，使用全自动索氏提取仪（Soxtec 2050, FOSS）测定种子含油量。将麻风树种仁和拟南芥种子磨碎过16目筛。干燥种子粉末（0.8-2.5克）装入套管，用石油醚（沸点60-90°C）提取1.5小时。提取完成后，105°C干燥5小时去除残留水和石油醚。根据种子干重计算含油量。
2.8 时域核磁共振（TD-NMR）测定种子含油量
使用minispec mq-one种子分析仪进行TD-NMR测定。麻风树新鲜种子65°C干燥至恒重（约48小时），水分含量低于5%的干种子可直接使用。通过索氏法提取的成熟麻风树种子油制作标准曲线。
2.9 气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定脂肪酸组成
约100微升麻风树或拟南芥种子油与1毫升甲醇-硫酸（2.5 M）在70°C水浴中反应30分钟，转化为甲酯。粗甲酯用1毫升正己烷萃取后进行GC分析。使用Agilent Technologies 7890A气相色谱仪（配备5975C质谱仪）和极性DB-WAX毛细管柱分离。氦气流速1毫升/分钟，分流进样（1:30）。柱温初始40°C保持2分钟，以5°C/分钟升至220°C，保持10分钟（总运行48分钟）。进样口、传输线和离子源温度分别为250°C、250°C和230°C。质谱条件为70 eV，质量范围m/z 35-500。通过比对标准品质谱图和保留时间鉴定各脂肪酸甲酯。
根据以下公式计算种子油不饱和度（DU）和生物柴油氧化稳定性（OS）：
DU = [C16:1] + [C18:1] + 2×[C18:2] + 3×[C18:3] （其中方括号表示摩尔百分比）
OS 计算基于脂肪酸组成。
2.10 高效液相色谱法测定可溶性糖
称取约0.5克粉末样品于离心管，加4毫升去离子水，涡旋30秒，室温超声30分钟。5000转/分钟离心5分钟后，上清液转移至5毫升容量瓶，水定容，0.22微米水相膜过滤后，HPLC分析蔗糖、D-果糖和D-葡萄糖。
2.11 种子蛋白质和淀粉含量分析
采用微量凯氏定氮法测定种仁粉末氮含量，乘以转换系数5.75估算蛋白质含量。采用蒽酮-硫酸法，630纳米波长下分光光度法测定总淀粉含量。
3 Results
3.1 JcSPL9在麻风树中的表达模式
qRT-PCR分析JcSPL9在麻风树不同发育阶段的表达谱。结果显示，JcSPL9表达水平随树龄增长而增加。最低表达水平出现在幼苗第一片叶；随树龄增长，JcSPL9表达水平持续增加。最高表达水平出现在幼苗子叶。第二高表达出现在5年生开花麻风树的幼叶中。JcSPL9在麻风树中的年龄依赖性表达模式与其他树种报道一致。检测单株麻风树不同器官中JcSPL9表达水平，发现JcSPL9在所有器官中均有表达，在果实中表达最高，根和叶中次之，茎和雌花中最低。这些结果表明JcSPL9表达在麻风树器官和发育阶段间存在显著差异，与拟南芥营养组织报道一致。
3.2 35S:rJcSPL9在拟南芥中表现出比35S:JcSPL9更强的表型
通过同义密码子替换miR156靶位点，产生miR156抗性JcSPL9（rJcSPL9）。rJcSPL9序列仅与JcmiR156a有12个核苷酸互补，不足以被miR156识别。获得表达35S:JcSPL9和35S:rJcSPL9的转基因拟南芥。35S:rJcSPL9的35个株系中，20个（57%）表现早花，选择表型最强的L18株系进行开花时间分析和遗传杂交。35S:JcSPL9的32个株系中，5个（16%）表现早花，选择L11株系进一步分析。以35S:JcmiR156a转基因L7为母本，获得35S:JcmiR156a (L7) × 35S:rJcSPL9 (L18) 和 35S:JcmiR156a (L7) × 35S:JcSPL9 (L11) 杂交转基因植株。PCR鉴定分别获得13和14株阳性F1代植株。分析WT、35S:rJcSPL9 (L18)、35S:JcmiR156a (L7) × 35S:rJcSPL9 (L18)、35S:JcSPL9 (L11)、35S:JcmiR156a (L7) × 35S:JcSPL9 (L11) 和 35S:JcmiR156a (L7) 的开花时间。结果显示，35S:rJcSPL9开花早于35S:JcSPL9；与35S:JcmiR156a杂交后，35S:JcmiR156a (L7) × 35S:rJcSPL9 (L18) 的开花时间无明显变化，rJcSPL9表达水平未下降。然而，35S:JcSPL9 (L11) 的早花表型在35S:JcmiR156a (L7) × 35S:JcSPL9 (L11) 植株中消失；JcSPL9表达水平下降至25%。这些结果表明miR156抗性JcSPL9在拟南芥中比35S:JcSPL9活性更强，因此选择rJcSPL9进行麻风树转化。
3.3 过表达rJcSPL9促进麻风树木质部发育和开花
在营养生长阶段，rJcSPL9过表达增加了腋芽数量和长度。此外，转基因麻风树的木质部厚度比WT厚0.15-0.35毫米，木质部加厚层数显著扩展。这些结果表明JcSPL9通过强烈促进木质部形成和抑制韧皮部及髓部发育来调控茎秆发育。此外，rJcSPL9转基因麻风树表皮蜡质积累增强。在生殖生长期间，35S:rJcSPL9转基因植株比WT开花早，每个花序的雌花和雄花数量显著增加。WT植株每个花序产生8.75朵雌花和143.63朵雄花。35S:rJcSPL9转基因植株每个花序产生12.83-14.12朵雌花和181.28-220.75朵雄花。但雌雄花比例在基因型间无差异。与生殖器官大小相比，发现转基因植株的花序、雄花、雌花、果序和果实均比WT小。
转基因植株产生显著更多的花序和果序。花数和花序数是控制种子产量的两个关键因素。比较主茎上的花序和果序数量：WT植株主茎产生1-3个花序/果序，而转基因植株主茎产生5-10个花序/果序。比较每株植物的花序和果序数量，一年生T0和T1代转基因植株均显著高于WT。具体而言，WT植株第一年每株产生约11个结构，而T1代转基因植株产生18-28个。随着转基因植株一级分枝数增加，其花序和果序数是WT的2-3倍；此外，与WT相比，L54植株每个果序的果实数增加约3.5个。3年生WT植株的果序数约为40个，而3年生转基因植株的果序数超过70个。花数和花序数的增加可能是rJcSPL9上调多个影响花序和花分生组织决定基因的结果，包括JcmiR172、JcAP1、JcLFY和JcSOC1。这些结果表明JcSPL9参与麻风树花序分生组织和花分生组织的决定。
3.4 过表达rJcSPL9改变果实和种子形态
rJcSPL9转基因麻风树的果实长度和宽度显著减小。L41植株产生的果实最小，长度和宽度比WT果实减少约7毫米。转基因种子也比WT种子小。转基因种子的长度和宽度显著减小。此外，转基因株系的单粒重比WT减少约0.3-1.0克。具体而言，L21、L41、L54和WT的10粒种子平均重量分别为6.44克、6.12克、6.90克和7.30克。后续年份也观察到类似结果。这些数据表明JcSPL9在调控麻风树果实和种子发育中起重要作用。
3.5 JcSPL9正向调控麻风树种子产量
如前所述，35S:rJcSPL9转基因麻风树比WT产生更多果实和更小种子。这些性状表明JcSPL9对麻风树农艺性状有显著影响。为评估种子产量，田间种植100株T1代转基因植株，比较第一年种子产量。单株种子重量分析显示，L21、L41和L54的第一年平均产量分别为181.13克、199.38克和235.71克，而WT为130.40克；转基因株系L54的种子产量比WT高80.76%。为确认结果，监测了随后2年的种子产量。第三年，转基因植株也产生更多果序并获得更高种子产量。L21、L41和L54每株平均种子产量分别为914.36克、914.36克和1128.34克，而WT为708.25克；L54株系产量比WT增加59.31%。
此外，2021年通过扦插繁殖WT、35S:rJcSPL9和35S:JcmiR156a T1植株，用于2022年种子产量分析。结果显示，L21、L41和L54的平均种子产量分别为499.29克、505.45克和765.23克，而每株WT平均种子产量仅为422.65克。35S:JcmiR156a T1转基因植株的平均种子产量，L8为241.04克，L28为305.62克。值得注意的是，L54比WT种子产量增加81.06%，而35S:JcmiR156a株系L8降低51.67%。35S:JcmiR156a转基因植株中JcSPL9表达降至WT水平的25%。这些结果表明JcSPL9正向调控麻风树种子产量。
3.6 JcSPL9调控含油量和脂肪酸（FA）组成
测定T1植株干种子含油量，结果显示转基因种子含油量L21为346.4毫克/克，L41为315.1毫克/克，L54为318.5毫克/克，而WT种子含油量约为307.7毫克/克。最高含油量出现在L21，增加约39.1毫克/克（相对增加12.63%）。然而，基因型间种仁百分比无显著差异。转基因种仁含油量增加10.4毫克/克至37.1毫克/克（相对增加2.14%至7.76%）。具体而言，L21、L41、L54和WT的种仁含油量分别为518.0毫克/克、493.9毫克/克、491.8毫克/克和481.8毫克/克。最高含油量出现在L21种仁，增加36.2毫克/克（相对增加7.54%）。基于这些数据，第一年WT、L21、L41和L54每株产油量分别为40.12克、62.74克、62.83克和75.07克，L21、L41和L54分别增加至1.564倍、1.566倍和1.871倍。此外，尽管种子重量略有下降，rJcSPL9株系L21在第二年和第三年的种子含油量分别增加36.0毫克/克（相对增加11.11%）和41.2毫克/克（相对增加12.01%）。为确认JcSPL9调控含油量，测定了T1代35S:JcmiR156a转基因麻风树含油量。结果显示，35S:JcmiR156a株系L8和L28的种子含油量分别为314.8毫克/克和325.2毫克/克，相对降低8.28%和5.22%。35S:JcmiR156a植株的种仁含油量也显著降低。还分析了粗蛋白、淀粉和可溶性糖含量；结果显示这些组分含量在rJcSPL9转基因植株中几乎都降低，而在JcmiR156a转基因植株中增加。
为进一步验证SPL9在拟南芥中调控油脂积累的功能，比较了WT、spl9突变
