有机阴离子转运多肽在Caco-2细胞单层及胃肠道中对胆汁酸摄取的贡献及其机制研究

《Journal of Biological Chemistry》：Contribution of organic anion transporting polypeptides to bile acid uptake in the Caco-2 cell monolayer and gastrointestinal tract

本研究聚焦于肠道胆汁酸吸收机制，发现除经典的顶端钠依赖性胆汁酸转运体（ASBT）外，有机阴离子转运多肽（OATP）家族成员（OATP1A2和OATP1B3）在Caco-2细胞及人源结肠类器官中同样介导了牛磺胆酸（TC）的摄取。该研究通过动力学分析、pH依赖性实验及基因/蛋白表达验证，揭示了Caco-2细胞中胆汁酸摄取存在双相动力学，且OATP1B3在结肠中高表达并定位于顶膜，提示其在结肠胆汁酸吸收中可能发挥补偿作用。这一发现对准确解读基于Caco-2模型的胆汁酸转运研究及探索结肠胆汁酸代谢新靶点具有重要意义。

　　

胆汁酸，作为胆固醇在肝脏中合成的两亲性分子，在人体内主要以胆酸和鹅脱氧胆酸的形式存在，并与牛磺酸或甘氨酸结合形成结合型胆汁酸，从而增强水溶性并降低肝脏毒性。它们被分泌到小肠后，不仅促进脂质和脂溶性维生素的吸收，更有超过95%的胆汁酸在回肠末端被重吸收回肝脏，进行所谓的“肠肝循环”。这一高效的循环过程对于维持体内胆固醇稳态至关重要：抑制回肠的胆汁酸重吸收会增加粪便中胆汁酸的排泄，进而促进肝脏利用胆固醇从头合成胆汁酸，最终达到降低血液胆固醇水平的效果。因此，靶向回肠胆汁酸重吸收的初始限速步骤——即由顶端钠依赖性胆汁酸转运体（Apical sodium-dependent bile acid transporter, ASBT，由SLC10A2基因编码）介导的摄取过程，已成为治疗血脂异常等代谢性疾病的重要策略，相关药物已进入临床应用。

然而，故事的另一面是，那些未被回肠吸收而进入结肠的胆汁酸，会被肠道菌群解结合并转化为次级胆汁酸，如脱氧胆酸和石胆酸。这些次级胆汁酸具有一定的细胞毒性，与结肠炎症甚至肿瘤的发生发展有关。在结肠，次级胆汁酸的吸收主要被认为是通过被动扩散进行。长期以来，ASBT被认为是人体肠道（尤其是回肠）胆汁酸吸收的主导转运蛋白，也是Caco-2细胞（一种广泛用于模拟肠道吸收的体外模型）中胆汁酸研究的主要对象。但越来越多的证据表明，Caco-2细胞中的胆汁酸摄取可能存在ASBT之外的机制。例如，早期的研究观察到Caco-2细胞中存在钠离子非依赖性的胆汁酸摄取，啮齿类动物肠道中也有类似发现，但其具体机制和生理意义尚不明确。这提示我们，对于广泛使用的Caco-2细胞模型，其胆汁酸转运机制可能比传统认知更为复杂，若忽视其他转运蛋白的存在，可能导致对研究结果的误判。此外，胆汁酸吸收是否在结肠也存在主动转运机制，也是一个有待阐明的科学问题。

为了深入探究这些问题，研究人员展开了一项系统性的研究，旨在阐明Caco-2细胞中牛磺胆酸（Taurocholic acid, TC）摄取的精确机制，并评估除ASBT外，其他转运蛋白，特别是有机阴离子转运多肽（Organic anion-transporting polypeptides, OATPs）家族成员，是否以及如何参与其中。该研究论文已发表在《Journal of Biological Chemistry》上。

研究人员首先在Caco-2细胞单层中进行了细致的TC摄取动力学分析。他们发现，TC的摄取呈现时间依赖性和浓度依赖性。在钠离子存在的缓冲液中，TC摄取量随时间线性增加；而在无钠条件下，摄取很快达到平台期。这表明钠离子依赖的ASBT是TC摄取的重要途径。然而，当研究人员进行浓度梯度实验并采用Eadie-Hofstee作图法分析时，发现TC摄取动力学呈现双相特征，强烈暗示至少有两种亲和力不同的转运系统参与其中。通过模型拟合（基于Akaike信息准则判断，双组分模型优于单组分模型），他们成功将总摄取分解为两个饱和组分：高亲和力、低容量的“转运蛋白1”（其动力学参数V_max为36.0 ± 31.8 pmol/mg protein/min，K_m为13.3 ± 10.7 μM）和低亲和力、高容量的“转运蛋白2”（V_max为293.8 ± 234.5 pmol/mg protein/min，K_m为338.3 ± 517.4 μM）。在低TC浓度下，转运蛋白1贡献主导；而当浓度升高超过25 μM时，转运蛋白2的作用则变得更为显著。

鉴于许多OATP家族的转运蛋白其活性具有pH依赖性，研究团队进一步考察了pH对TC摄取的影响。结果发现，在pH 6.0的酸性条件下，Caco-2细胞对TC的总摄取量显著高于pH 7.4的条件。动力学分析再次显示双相特征，并且转运蛋白2在pH 6.0时的转运能力（V_max）远高于pH 7.4时，表明该组分对pH变化敏感，这符合OATP家族的典型特征。当Caco-2细胞培养时间从1周延长至2周（使其分化更成熟）后，TC的总摄取速率有所下降，且pH引起的差异减小，但双相动力学特征依然存在，提示多种转运蛋白的参与是持续性的，但其相对贡献可能随细胞状态变化。

为了验证“转运蛋白1”的身份，研究者在COS7细胞中过表达了人源ASBT。结果显示，ASBT介导的TC摄取呈现典型的单相饱和动力学，其K_m值（pH 7.4时为15.0 ± 4.3 μM）与Caco-2细胞中的“转运蛋白1”非常接近，从而确认“转运蛋白1”就是ASBT。那么，“转运蛋白2”的真身是谁？研究人员将目光投向了OATP家族。他们通过在HEK293T细胞中分别过表达9种人源OATP（OATP1A2, 1B1, 1B3, 2A1, 2B1, 3A1, 4A1, 4C1, 5A1），并检测它们对TC的摄取能力。筛选结果表明，OATP1A2、OATP1B1和OATP1B3能够显著介导TC的摄取，且OATP1A2和OATP1B3的摄取活性在pH 6.0时显著增强。OATP2B1也表现出TC转运活性，但仅在于pH 6.0条件下，且活性较低。

接下来，研究团队回到Caco-2细胞模型，通过RT-qPCR和蛋白质印迹（Western blot）检测了这些候选OATP的表达。基因表达分析显示，Caco-2细胞表达OATP1A2和OATP1B3的mRNA，但不表达OATP1B1。蛋白质水平上，ASBT的蛋白表达量在不同培养周数间无显著变化，OATP1A2的表达在培养2周时增加而后下降，而OATP1B3的蛋白表达在培养1周时最高，随后随时间延长而降低。免疫荧光染色结果进一步证实，在Caco-2细胞单层中，ASBT和OATP1B3均与顶膜标志物Ezrin共定位，说明它们都表达在细胞的顶膜侧，这为其参与胆汁酸摄取提供了细胞学定位依据。

为了评估这些发现在人体内的相关性，研究人员分析了人肠道组织样本以及人源肠道类器官。在商业来源的人肠道总RNA中，ASBT在回肠高表达，OATP1B3在结肠表达较高，而OATP1A2表达量很低。利用从健康人结肠组织建立的类器官模型，研究人员证实了OATP1B3在类器官来源的单层细胞中有蛋白表达，且其与顶膜标志物ZO-1和F-actin共定位。更重要的是，该结肠类器官单层表现出TC的跨膜转运活性，TC能从顶侧转运至基底侧，并在细胞内有蓄积，这表明类器官模型具备了功能性胆汁酸转运能力，OATP1B3很可能在其中发挥作用。

本研究主要应用了以下几项关键技术方法：1）利用Caco-2细胞单层模型进行时间、浓度和pH依赖性的胆汁酸（TC）摄取动力学分析，以解析其转运机制；2）采用基因过表达系统（COS7和HEK293T细胞）进行候选转运蛋白（ASBT和OATP家族成员）的功能性筛选和验证；3）运用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）技术检测Caco-2细胞、人肠道组织总RNA（商业来源）以及人源结肠类器官中相关转运蛋白的基因和蛋白表达水平；4）通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察，确定ASBT和OATP1B3在Caco-2细胞单层和人源结肠类器官单层细胞中的亚细胞定位；5）建立并利用人源结肠类器官（源自健康人手术样本的健康组织）培养体系及其分化形成的单层细胞模型，进行TC转运实验，以模拟人体结肠上皮的转运功能。

钠依赖性和浓度依赖性

研究人员首先证实了Caco-2细胞对TC的摄取是时间依赖性和钠依赖性的。通过Eadie-Hofstee作图分析浓度依赖性数据，发现TC摄取遵循双相动力学，表明存在高亲和力（转运蛋白1，即ASBT）和低亲和力（转运蛋白2）两种转运机制。转运蛋白2在较高TC浓度下贡献更大。

pH依赖性

在pH 6.0条件下，TC的总摄取量高于pH 7.4，且转运蛋白2的活性（V_max）显著增强，表现出明显的pH依赖性，这与OATP家族的典型特征相符。培养2周的细胞其pH依赖性差异减小。

ASBT的功能验证

在过表达ASBT的COS7细胞中，TC摄取呈现单相饱和动力学，其K_m值与Caco-2细胞中的高亲和力组分（转运蛋白1）高度一致，从而证实了ASBT是Caco-2细胞中高亲和力TC摄取的主要承担者。

OATP家族成员的筛选与鉴定

在9种人源OATP中，功能筛选发现OATP1A2、OATP1B1和OATP1B3能有效介导TC摄取，且OATP1A2和OATP1B3的活性在酸性pH下增强。OATP2B1仅在pH 6.0下有较弱活性。

Caco-2细胞中OATP的表达与定位

基因和蛋白水平检测证实Caco-2细胞表达OATP1A2和OATP1B3，但不表达OATP1B1。免疫荧光显示OATP1B3与ASBT一样，定位于Caco-2细胞单层的顶膜。

人肠道及类器官中的表达与功能

人组织RNA分析显示ASBT回肠高表达，OATP1B3结肠表达较高。人源结肠类器官的蛋白表达和免疫荧光证实OATP1B3定位于类器官单层细胞的顶膜。功能性转运实验证明该模型具有TC的跨膜转运能力。

本研究通过系统的体外和类器官模型研究，清晰地揭示了Caco-2细胞中胆汁酸摄取存在由ASBT和OATP（主要是OATP1A2和OATP1B3）共同介导的双重机制。这一发现挑战了ASBT是Caco-2细胞中唯一胆汁酸转运蛋白的传统观点，提示在使用该模型进行胆汁酸转运相关研究时，需谨慎解读结果，特别是要考虑OATP的贡献，尤其是在不同的培养条件和底物浓度下。

更重要的是，研究首次在蛋白水平和功能层面证实了OATP1B3在人体结肠组织来源的类器官中有表达且定位于顶膜，并具备TC转运活性。这强烈暗示，在人体结肠中，除了被动扩散，可能还存在由OATP1B3介导的胆汁酸主动摄取途径。这为理解结肠的胆汁酸代谢开辟了新视角。OATP1B3在结肠的表达，可能作为一种补偿机制，吸收那些逃逸回肠ASBT吸收的胆汁酸。考虑到结肠内容物通常偏酸性，OATP1B3的pH依赖性活化特性使其非常适合在这一环境中发挥作用。

该研究的发现具有多重重要意义。首先，它深化了对肠道胆汁酸吸收复杂性的认识，表明转运机制存在部位特异性（回肠 vs 结肠）和浓度依赖性。其次，研究明确了Caco-2细胞模型的局限性，指出其转运蛋白表达谱与正常人肠道存在差异，为更合理地设计和解释基于该模型的实验提供了重要依据。此外，OATP1B3作为结肠中潜在的胆汁酸转运体，其发现可能为胆汁酸相关疾病（如代谢综合征、结肠炎症、结直肠癌）的机制研究和药物研发提供新的潜在靶点。例如，在肠道炎症状态下，ASBT功能可能受损，导致更多胆汁酸进入结肠，此时OATP1B3的表达和功能变化可能影响疾病进程。未来研究需要进一步阐明OATP1B3在人体结肠生理和病理条件下的具体调控机制和功能权重，以及不同OATP成员在胆汁酸肠肝循环中的协同与拮抗作用。