基于受激拉曼散射波长生成的多光谱激光扫描光声显微镜用于皮肤发色团表征

《Journal of Biophotonics》：Multispectral Laser-Scanning Photoacoustic Microscopy With SRS-Generated Wavelengths for Skin Chromophore Characterization

本刊推荐：本文报道了一种集成受激拉曼散射（SRS）波长生成技术的多光谱激光扫描光声显微镜（MS-LS-PAM）平台。该技术利用单一泵浦源（532 nm）通过偏振维持光纤产生可调谐激发波长（532-571 nm），实现了对皮肤关键内源性发色团——氧合血红蛋白（HbO2）、脱氧血红蛋白（Hb）、黑色素和胶原蛋白的高分辨率、无标记成像。通过非负最小二乘法（NNLS）进行光谱分离，在活体小鼠实验中成功实现了发色团精准分离、空间分辨氧饱和度（sO2）映射及胶原/黑色素结构可视化，为皮肤病学诊断提供了新型功能成像工具。

　　

引言

光声显微镜（PAM）作为一种混合生物医学成像模式，通过结合光学激发与超声检测，基于生物组织的光学吸收特性生成高分辨率、高对比度图像。在光学分辨率PAM（OR-PAM）中，通过紧密光学聚焦实现微米级横向分辨率，尤其适用于浅表组织可视化。激光扫描PAM（LS-PAM）通过光栅扫描激光束同时保持超声换能器静止，进一步提升了成像速度与系统简易性。多光谱PAM（MS-PAM）通过在多波长下采集数据，利用发色团独特吸收光谱扩展了PAM的结构成像能力，支持如绘制血氧饱和度（sO₂）等功能成像任务。在皮肤病学成像领域，光声成像已成为评估黑色素瘤的新兴工具之一。受激拉曼散射（SRS）在偏振维持光纤中为多光谱激发提供了一种紧凑、经济有效的解决方案。

材料与方法

MS-PAM系统配置采用倍频Nd:YAG DPSS激光器（532 nm，13 ns脉冲宽度，5 kHz重复频率）作为光学激发源。利用50米偏振维持单模光纤（PM-SMF）产生SRS效应，通过可旋转滤光轮选择特定波长（532/545/558/571 nm）。扫描系统采用二维振镜扫描器与F-θ透镜（焦距10 cm），实现6×6 mm²视场的均匀聚焦。超声检测单元采用透明水槽与Saran膜窗进行声耦合，每帧采集10,000个点（100×100），像素驻留时间200 μs。

SRS效应表征表明，脉冲重复频率（PRR）与光纤长度显著影响SRS级联效应。较低PRR（5-10 kHz）与较长光纤（40-50 m）可产生完整的斯托克斯频移波长序列。SRS阈值功率与光纤长度、拉曼增益系数等参数相关，遵循经典非线性光纤光学理论。

动物实验选用3周龄C57BL/6J（B6）色素沉着小鼠与5周龄SKH1无毛（黑色素缺陷）小鼠的腹部皮肤进行活体成像。通过异氟烷麻醉、脱毛处理与超声耦合凝胶实现稳定成像条件。

信号处理采用专为本研究开发的深度学习增强模型，包含编码器-注意力-解码器架构，结合L1重建损失与多尺度STFT损失进行训练。希尔伯特变换包络积分（AUC）作为光学吸收能量的替代指标，通过能量归一化与空间配准获得四个波长的光声图像。

光谱分离与发色团定量采用非负最小二乘（NNLS）与Tikhonov正则化求解线性反演问题。通过Frangi滤波器生成血管掩膜，结合蒙特卡洛模拟确定160 μm安全边界，分别对血管内（HbO₂/Hb）与真皮区域（胶原/黑色素）进行独立解混。sO₂计算基于血红蛋白浓度比，胶原与黑色素相对浓度通过比例计算获得。k-Wave仿真验证显示发色团估计误差低于0.18%。

结果与讨论

SRS特性研究表明，PRR增加会导致SRS级联效应减弱，而光纤长度增加显著增强非线性相互作用。输入脉冲能量实验证实较长光纤可降低SRS阈值并产生更广泛的斯托克斯波长。

多光谱成像结果显示，B6小鼠皮肤在四个波长下均呈现清晰血管网络，氧饱和度映射显示小动脉（高sO₂）与小静脉（低sO₂）的生理分布。胶原图谱显示密集连续的真皮分布（98-99.5%），黑色素信号局限于表皮基底层（0.5-2%）。SKH1无毛小鼠血管sO₂为77-81%，胶原占主导（99.9%），黑色素稀疏（0.1%），与生化报告一致。

系统局限性包括可见光范围灵敏度限制、Grüneisen系数差异可能引起的定量偏差，以及脂质/水吸收系数过低导致的检测挑战。与超连续谱激光器相比，SRS源在千赫兹重复频率下提供更高脉冲能量，更适合光声显微成像。选择532 nm泵浦波长优先考虑血管对比度与分辨率，未来结合1064 nm激发可扩展脂质成像能力。

结论

本研究开发的LS-PAM系统整合SRS波长生成技术，实现了皮肤微血管与真皮结构的高分辨率无标记成像。通过靶向光谱分离策略与NNLS算法，在活体小鼠皮肤中成功获得生理合理的发色团分布。系统在色素沉着与无毛模型中均验证了胶原主导真皮组成、黑色素含量菌株差异性的生物学特征，为皮肤病学诊断提供了功能与结构信息整合的新型成像平台。未来工作将拓展波长范围、实现实时重建并开展纵向疾病进展研究。