《Journal of Biological Chemistry》：A disease-causing Isoleucyl-tRNA synthetase variant leads to altered protein complex formation and cellular stress response
编辑推荐：
为破解“非催化域突变如何引发aaRS相关神经退行”难题，作者利用CRISPR prime editing构建IARS1细胞模型，发现蛋白水平骤降70%却不影响整体翻译，而是削弱MSC组装并抑制低糖诱导的ATF4信号，提出“复合体失稳-应激适应缺陷”致病新范式。
在蛋白质合成这条“生命流水线”上，氨酰-tRNA合成酶（aaRS）像精准分拣员，把20种氨基酸准确送到对应tRNA手中。然而，当这些“分拣员”自己出现遗传差错时，细胞会发生什么？过去研究多聚焦于催化域突变导致氨酰化受损，从而引发神经退行、脑白质营养不良等毁灭性疾病。但临床发现，约半数致病突变落在非催化域，患者症状却依旧严重，提示“ catalytic activity 下降”并非唯一故事。尤其令人困惑的是，IARS1（编码异亮氨酰-tRNA合成酶，IleRS）两个非催化UNE-I域的点突变，在不影响整体蛋白合成的条件下，仍能诱发婴幼儿神经发育障碍——这背后隐藏的分子“暗线”亟待揭开。
为回答“非催化突变如何致病”，多伦多大学Cui团队把目光锁定在c.3521T>A（p.Ile1174Asn，简称I1174N）这一临床突变。该位点位于介导IleRS与EPRS、LeuRS形成多氨酰-tRNA合成酶复合体（MSC）III亚复合物的UNE-I域，却远离活性口袋。作者推测：突变可能“撼动”复合体架构，进而通过蛋白稳定性或应激信号放大损伤。为此，他们利用CRISPR prime editing在HEK293T内源IARS1位点精准敲入I1174N，构建纯合突变细胞模型，系统追踪蛋白命运、复合体完整性及细胞应激应答。
研究首先发现，I1174N突变使IleRS蛋白水平骤降约70%，而mRNA丰度不变，提示翻译后事件作祟。蛋白酶体抑制剂MG132可部分“挽救”蛋白量，说明突变体一旦被踢出复合体，就面临泛素-蛋白酶体途径快速降解。出乎意料的是，tRNA测序显示异亮氨酰-tRNA充电率与野生型无异，整体蛋白合成速率及细胞增殖亦未受损，表明“催化功能”并非突变短板。
那么问题究竟出在哪？尺寸排阻色谱给出线索：突变细胞中全长IleRS在~1 MDa MSC峰显著减少，而游离形式增多；与之相伴，LeuRS亦脱离复合体，提示III亚复合物松动。免疫共沉淀-质谱联用进一步证实，I1174N-IleRS与EPRS、ArgRS、MetRS等MSC成员的互作几乎消失，仅保留与LeuRS的微弱结合，说明突变像“楔子”一样撬开了IleRS-EPRS界面，导致复合体碎片化。
复合体解体带来的连锁反应很快显现。整合应激反应（ISR）是细胞感知氨基酸或能量短缺的核心通路，转录因子ATF4为其关键执行者。Western blot显示，在完全培养基中，I1174N细胞ATF4基准水平已低于野生型；当切换到1 g/L低糖环境，野生型ATF4迅速上调，而突变株却“反应迟钝”，差异在4–16 h持续扩大。值得注意的是，eIF2α磷酸化水平无显著差异，提示ISR下调发生在翻译或蛋白稳定层面，而非经典激酶级联。低糖条件下，突变细胞mTORC1下游p-S6K1下降速度放缓，与LeuRS脱离MSC、胞内亮氨酸感知减弱相吻合，进一步佐证“营养感知-应激耦合”受损。
作者还排除了应激颗粒（G3BP1标记）形成异常、CHOP等ATF4靶基因转录改变等次级假说，将焦点锁定于“ATF4蛋白自身下调”这一核心表型。结合临床遗传学——患者为I1174N/R418*复合杂合，父母各自携带单突变却无症状——提示I1174N的“复合体失稳-应激适应缺陷”需与催化无效等位基因叠加，方足以将IleRS功能推向疾病阈值。
至此，一幅新的致病路线图清晰浮现：非催化域突变→复合体装配受挫→突变蛋白降解+伙伴酶脱离→营养应激下ATF4信号不足→细胞适应力下降，最终在高耗能组织（如大脑）诱发发育障碍。该模型首次将“MSC架构完整性”与“ISR动态范围”直接挂钩，为解释aaRS非催化突变致病提供普适框架。
主要技术方法：CRISPR prime editing内源点突变、尺寸排阻色谱-免疫印迹解析复合体完整性、tRNA-seq定量氨酰化水平、嘌呤霉素掺入测定整体翻译速率、免疫共沉淀-质谱绘制互作组、Western blot监测ATF4/ISR及mTOR-S6K1轴。
研究结果：
建立IARS1纯合细胞模型——蛋白水平降70%，mRNA不变，MG132部分挽救，提示蛋白酶体降解。
I1174N不影响tRNA氨酰化、总体蛋白合成及增殖——催化功能充足。
突变导致全长IleRS脱离MSC，LeuRS随之解离，III亚复合物碎片化。
互作组质谱显示IleRS-EPRS、IleRS-ArgRS等关联丢失，仅余LeuRS弱结合。
基准及低糖胁迫下ATF4下调，eIF2α-P不变，mTORC1-p-S6K1衰减延迟，提示ISR-营养感知耦合受损。
应激颗粒与靶基因转录无异常，排除下游次级效应。
结论与讨论：
该研究首次阐明非催化域突变可通过“复合体失稳-蛋白降解-应激适应”三重机制独立于氨酰化缺陷致病，拓展了aaRS病理范式。MSC不仅是催化平台，更是细胞感知营养、调配应激的“信号枢纽”，其完整性直接影响ATF4动态范围。鉴于大脑对葡萄糖与氨基酸波动极度敏感，I1174N导致的ISR“钝感”可能构成神经发育障碍的分子基础。未来在患者来源神经元、脑类器官中验证“应激适应缺陷”表型，并筛选稳定突变蛋白或强化ISR的小分子，有望为这类“非催化型”aaRS病提供精准干预策略。论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。
