《Journal of Biological Chemistry》：The cytoplasmic protein YedX is a potent inhibitor of CsgA amyloid assembly in E. coli
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本研究针对大肠杆菌中易聚集的淀粉样蛋白前体CsgA在胞质内如何维持可溶性状态这一关键问题，开展了关于胞质蛋白YedX功能探索的主题研究。研究人员通过多种生物物理和生物化学技术，发现YedX能有效抑制CsgA的淀粉样纤维组装，使其保持在可溶、无毒的状态。该研究揭示了YedX在维持胞内蛋白质稳态中的新功能，为理解细菌功能淀粉样蛋白的调控机制提供了新视角，并对抗生物膜策略研究具有启示意义。
在细菌的世界里，生物膜是它们赖以生存的重要“社区”。这些由细菌自身分泌的胞外基质构成的庇护所，不仅能帮助细菌获取资源、相互通讯，还能有效抵御外界恶劣环境。在构成生物膜的多种成分中，有一类名为“功能淀粉样蛋白”的特殊蛋白质纤维，它们与导致阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的“坏”淀粉样蛋白结构相似，却对细菌的生存至关重要。在大肠杆菌中，这种功能淀粉样蛋白被称为卷曲菌毛，其主要组成单元是CsgA蛋白。
然而，一个有趣的矛盾随之而来：CsgA蛋白在细胞内合成时具有极高的聚集倾向，若在胞质内就发生错误聚集，不仅会丧失功能，还可能对细菌自身产生毒性。因此，细菌演化出了一套精密的调控系统，确保CsgA只有在抵达细胞表面后才组装成有益的淀粉样纤维。此前的研究已知，在周质空间中，一种名为CsgC的蛋白质能有效抑制CsgA的过早聚集。那么，在拥挤而复杂的细胞质内，又是哪些“守护者”在默默维持着CsgA的可溶性状态呢？除了已知的DnaK、Hsp33等分子伴侣，是否还存在新的调控因子？
由Bharat Gurnani和Neha Jain共同完成，发表在《Journal of Biological Chemistry》上的这项研究，将目光投向了一个名为YedX的胞质蛋白。YedX原本以其在嘌呤代谢中作为水解酶的功能而为人所知。研究人员敏锐地注意到，YedX在结构上与周质淀粉样蛋白抑制因子CsgC和CsgH有着惊人的相似性，尽管它们的氨基酸序列相似度很低。这一结构上的线索促使研究者提出了一个大胆的假设：YedX是否也具备抑制CsgA淀粉样组装的新功能？为了验证这一猜想，他们展开了一系列深入细致的探索。
为开展本研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：通过序列和结构比对分析蛋白质相似性；利用尿素变性实验、色氨酸荧光光谱、圆二色谱和ANS荧光探针等手段系统表征YedX的结构稳定性与去折叠动力学；采用硫黄素T荧光动力学监测蛋白质聚集过程；借助场发射扫描电子显微镜观察纤维形态；通过凝胶溶解度分析、动态光散射和细胞毒性实验评估蛋白质聚集状态与生物相容性；运用Raster Image Correlation Spectroscopy分析蛋白质相互作用与扩散系数；并进行了体外酶活测定、蛋白质-蛋白质分子对接模拟以及细菌生物膜形成实验等。
YedX与CsgC和CsgH具有显著的结构相似性
研究人员首先通过生物信息学分析发现，尽管YedX与CsgC、CsgH的序列相似性仅分别为16%和14%，但它们的三维结构却高度相似。将YedX的单体结构与CsgC、CsgH进行叠加后，计算得到的RMSD值分别为3.23 ?和2.65 ?，表明它们具有相似的β-折叠片层核心结构。这种“低序列相似性、高结构相似性”的特点，强烈提示YedX可能具有与CsgC类似的功能。
YedX的化学去折叠是一个两步过程
深入了解YedX本身的结构特性是理解其功能的基础。研究人员通过尿素变性实验发现，YedX的去折叠过程并非简单的一步完成，而是一个从天然态到中间态再到去折叠态的两步过程。在3-3.5 M尿素浓度下，YedX形成一个部分去折叠的中间状态，其色氨酸荧光发射峰发生红移，荧光强度增强，圆二色谱信号也表明β-折叠结构开始丢失。这种复杂的去折叠途径反映了YedX结构的稳定性，而一个稳定的结构对其行使潜在的抗淀粉样蛋白活性可能至关重要。研究还证实，正确折叠的YedX具有5-羟基异尿酸盐水解酶活性，而去折叠的YedX则丧失了该酶活。
胞质YedX是大肠杆菌中周质CsgC的功能同源物
核心问题来了：YedX能否真正抑制CsgA的淀粉样纤维形成？答案是肯定的。硫黄素T荧光动力学实验表明，YedX能以浓度依赖的方式有效抑制CsgA的淀粉样组装。当CsgA与YedX的摩尔比为10:1时，可以完全抑制纤维的形成。显微镜观察进一步证实，在YedX存在下，CsgA无法形成典型的长而不分枝的淀粉样纤维。
YedX将CsgA导向可溶性、无毒且聚集无能的寡聚体
抑制纤维形成固然重要，但更关键的是，YedX将CsgA引导至何种状态？是变成了可溶但有毒的寡聚体，还是安全的中间态？研究人员的发现令人鼓舞：离心后的上清液和沉淀物的凝胶电泳分析显示，YedX的存在使CsgA主要存在于可溶部分。动态光散射分析表明，YedX阻止了CsgA形成大尺寸的聚集体。更重要的是，细胞毒性实验证明，YedX调控下的CsgA产物对神经细胞系没有毒性作用。这些结果综合表明，YedX能够将高度聚集倾向的CsgA“扣押”在一种可溶、无毒且不再继续聚集的“良性”状态。
YedX通过静电相互作用阻滞CsgA聚集
YedX是如何与CsgA相互作用的？研究人员利用Raster Image Correlation Spectroscopy技术发现，YedX与CsgA结合后，其扩散系数显著降低，表明两者形成了稳定的复合物。当提高溶液的离子强度时，YedX的抑制效果随之减弱，提示静电相互作用在两者结合中扮演了关键角色。蛋白质分子对接模拟进一步揭示了YedX与CsgA之间可能的相互作用界面。
YedX优先捕获早期聚集体并与CsgA的多个位点相互作用
YedX的作用具有选择性。它能够有效抑制主要亚基CsgA的聚集，但对成核蛋白CsgB的快速聚集则无明显的抑制作用。此外，YedX在CsgA聚集过程的早期（0、1、2小时）加入均能有效终止纤维形成，但如果加入预先形成的CsgA“种子”来加速聚集，YedX的抑制效果则会打折扣，表明它更擅长于捕捉聚集途径上的早期物种。通过使用CsgA的不同截短体（ΔR1, ΔR3, ΔR5）进行实验，研究发现YedX能够抑制这些变异体的聚集，提示YedX可能与CsgA的多个区域相互作用，从而发挥其抑制功能。
YedX既不分解预形成的纤维，也不阻止CsgA依赖的生物膜形成
YedX的功能也存在局限性。它无法分解已经形成的成熟CsgA淀粉样纤维，说明它不具备“解聚酶”活性。更有趣的是，当研究人员将YedX直接添加到细菌培养基中时，它并不能抑制大肠杆菌UTI89菌株的生物膜形成。在模拟细胞外环境的实验中（包含CsgA、CsgB和脂多糖囊泡），YedX也无法阻止CsgB介导的CsgA共聚集。这表明YedX的功能具有空间特异性，其主要作用场所在细胞质内，而非细胞外环境。
本研究得出结论：胞质蛋白YedX是CsgA淀粉样组装的有效抑制剂，其在细胞质内发挥着与周质蛋白CsgC相似的功能，共同构成了一个确保淀粉样蛋白前体安全转运的多层次调控网络。这一发现不仅揭示了YedX在细菌蛋白质稳态维持中的新角色，拓展了对功能淀粉样蛋白生物发生调控机制的理解，更体现了“结构决定功能”这一生物学基本原理的深刻性。从CsgC、CsgH到YedX，再到与人类转甲状腺素蛋白的结构功能类比，这些研究表明，具有特定β-折叠片层结构的蛋白质可能天然具备调控其他蛋白质聚集的潜力。这一发现为开发针对细菌生物膜或人类神经退行性疾病中淀粉样蛋白聚集的新型干预策略提供了新的思路和潜在的分子模板。未来的研究，例如在细菌体内敲低YedX基因并观察其对胞内CsgA溶解度的影响，将能进一步在生理背景下验证这一有趣假说。
