《Journal of Chromatography A》：Box-Behnken Optimized Salting-Out Assisted Liquid-Liquid Extraction Coupled with LC-MS/MS for Sustainable Amisulpride Quantification in Human Plasma
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本研究开发并验证了一种可持续的盐析辅助液液萃取结合液相色谱-串联质谱法（SALLE-LC-MS/MS），用于氨斯林普ride的血浆定量。通过Box-Behnken设计优化参数（pH 8.5、乙腈1200 μL、醋酸铵4.5 mol/L、离心3分钟），实现97.6%回收率，符合ICH M10指南。临床实验验证药代参数（Cmax 506 ng/mL，t1/2 13.3 h），并通过CaFRI、BAGI、RGB12评估确认环境友好性和实施可行性。
艾哈迈德·塞拉格（Ahmed Serag）|玛娜尔·E·阿洛赛米（Manal E. Alosaimi）|马拉姆·H·阿卜杜勒贾巴尔（Maram H Abduljabbar）|阿德南·阿尔哈比（Adnan Alharbi）|法伊萨尔·阿尔塞纳尼（Faisal Alsenani）|法鲁克·M·阿尔穆泰里（Farooq M. Almutairi）|穆尼夫·M·阿尔达菲里（Muneef M. Aldhafeeri）|阿蒂亚·H·阿尔马尔基（Atiah H. Almalki）
埃及开罗纳斯尔市阿尔-阿扎尔大学药学院药物分析化学系，邮编11751
摘要
本研究开发并验证了一种基于盐析辅助的液-液萃取与液相色谱-串联质谱（SALLE-LC-MS/MS）联用技术，用于根据ICH M10指南对人血浆中的阿米苏普利德（amisulpride）进行定量分析。通过Box-Behnken实验设计系统优化了SALLE法中的参数，包括样品pH值（5.0-10.0）、乙腈体积（500-1500 μL）、盐浓度（2.0-6.0 mol/L）和离心时间（3.0-10.0分钟）。所建立的多项式模型表现出很强的预测能力，进一步通过数值优化确定了最佳条件：pH值为8.5、乙腈体积为1200 μL、醋酸铵浓度为4.5 mol/L以及离心时间为3分钟。在这些条件下，阿米苏普利德的提取回收率达到了97.6%，且与预测值之间的偏差很小。优化完成后，采用C18色谱柱和等度洗脱方案（乙腈：水，含0.1%甲酸，体积比70:30）进行分离，分析时间为4分钟。同时利用m/z 370.1→242.1的跃迁作为阿米苏普利德的检测峰，m/z 376.2→165.1的跃迁作为氟哌啶醇（haloperidol）的内标峰。全面验证结果显示，在2-1500 ng/mL的浓度范围内该方法具有线性关系，准确度、精密度和稳定性均符合要求。基质效应范围为88-105%，且所有质量控制水平的提取回收率均超过98%。在健康志愿者（n=5）中，口服200 mg阿米苏普利德后，成功测定了关键的药代动力学参数，包括Cmax（506 ng/mL）、tmax（3.8 h）和t1/2（13.3 h）。此外，通过CaFRI（75/100）、BAGI（77.5/100）和RGB12（83.1/100）等多指标可持续性评估框架，证实了该方法在分析性能、环境友好性和实际应用可行性方面的优势，包括减少废物产生、降低溶剂消耗和提高通量，同时满足阿米苏普利德治疗药物监测的法规要求。
引言
阿米苏普利德是一种取代苯甲酰胺衍生物，属于非典型抗精神病药物，具有独特的药理特性，因此需要专门的生物分析方法来进行准确定量[1]。作为高度选择性的多巴胺D2和D3受体拮抗剂，其Ki值分别为2.8和3.2 nmol/L，对多巴胺能受体的亲和力比其他神经递质系统高几个数量级[2]。该药物具有剂量依赖性的双重作用机制：低剂量时作为突触前自身受体阻断剂增强多巴胺传递，高剂量时作为突触后受体拮抗剂发挥作用，从而在管理精神疾病的症状方面具有独特的治疗优势[3,4]。这种独特的药理特性使阿米苏普利德成为一种有效的药物，其疗效优于第一代抗精神病药，与第二代药物相当[5]。阿米苏普利德主要通过肾脏排泄，大约三分之二的静脉给药量在12小时内被清除，其药代动力学受肾功能参数显著影响[6,7]。由于个体间存在较大差异，强烈建议进行治疗药物监测，国际共识指南规定的治疗血浆浓度范围为100-320 ng/mL，实验室警戒浓度为640 ng/mL[8]。鉴于这些药代动力学特性以及准确监测的迫切需求，开发出灵敏、可靠且环境可持续的分析方法对于优化临床管理至关重要[9]。
文献显示，色谱法在阿米苏普利德定量分析中占据主导地位，分析平台从传统的紫外检测技术发展到更先进的技术，以应对灵敏度和选择性挑战。早期的液相色谱方法采用紫外检测，虽然性能尚可，但在分析复杂生物样本时灵敏度和选择性较差，需要复杂的样品预处理步骤[10,11]。为克服这些限制，随后开发了荧光检测方法，其在274 nm和370 nm的激发和发射波长下表现出更高的灵敏度，灵敏度提高了六倍[12,13]。然而，这些荧光方法存在诸多局限性，如需要多步骤的样品处理、高温下的溶剂蒸发以及耗时且易出错的重构过程，尤其是在处理大量样本时[12,13]。此外，荧光检测方法的选择性有限，且可能受到复杂生物样本中内源性化合物的干扰。气相色谱-质谱（GC-MS）技术也用于全血样本中阿米苏普利德的测定，但该方法需在室温下使用七氟丁酸酐进行30分钟的衍生化处理以提高分析物的挥发性，从而延长分析时间并引入额外误差[14]。相比之下，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）已成为最灵敏的分析平台，其定量下限低至2.0-20.0 ng/mL，分析时间缩短至2.5-12分钟[15,16,17,18]。不过，这些方法主要依赖于传统的萃取技术，如使用乙醚或甲基叔丁基醚等有机溶剂的液-液萃取以及传统的固相萃取程序[15,17,19]。尽管已经开发出自动化在线固相萃取技术，可将总分析时间缩短至10分钟，但蛋白质积累和方法稳定性问题仍限制了其临床应用[20]。现有方法缺乏系统的实验设计优化、全面的绿色分析化学评估以及符合ICH M10指南的验证方法，这些因素凸显了开发环境可持续、系统优化的分析方法的必要性。
在新兴的萃取技术中，盐析辅助的液-液萃取（SALLE）作为一种环境可持续的替代方法受到了广泛关注，解决了现有阿米苏普利德生物分析方法的局限性[21,22]。SALLE技术通过向含有水溶性有机溶剂（如乙腈、甲醇或丙酮）的混合物中添加无机或有机盐来诱导相分离，破坏溶剂化作用并同时实现蛋白质沉淀[23,24]。该方法具有操作简单、成本低廉、执行速度快、溶剂消耗少、环境兼容性高等优点，优于复杂的固相萃取程序[25,26]。此外，SALLE能够从广泛的极性范围内提取化合物，并与现代分析仪器（如LC-MS/MS系统）兼容，特别适合阿米苏普利德的定量[27]。SALLE参数的优化通过实验设计方法进行，特别是Box-Behnken设计与响应面方法相结合，解决了现有方法中缺乏系统优化的问题[28,29]。这种多变量优化方法考虑了盐类型和浓度、有机溶剂体积和pH值、样品pH值、涡流混合时间以及离心条件等关键参数，并考虑了传统单因素优化方法无法充分处理的变量间相互作用[30]。响应面方法还促进了萃取过程的数学建模，通过统计评估实验值与理论值的差异来预测最佳条件并评估方法稳定性，可能有助于克服现有阿米苏普利德生物分析方法中的重复性问题[31]。
鉴于现有阿米苏普利德生物分析方法的局限性以及缺乏环境可持续的分析方法，本研究旨在开发并全面验证一种新的分析框架，以解决这些方法学问题。具体目标包括：(i) 利用盐析辅助的液-液萃取技术开发并优化一种灵敏的LC-MS/MS方法，用于人血浆中阿米苏普利德的定量分析，这是该方法首次应用于阿米苏普利德生物分析；(ii) 通过Box-Behnken实验设计系统优化SALLE参数，以提高萃取效率并识别协同作用因素组合；(iii) 根据ICH M10指南全面验证该方法，确保其临床应用的合规性，包括选择性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性和基质效应的评估；(iv) 通过健康志愿者的药代动力学研究验证其实际应用性，为阿米苏普利德的治疗药物监测提供实际验证；(v) 使用多指标绿色分析化学框架（CaFRI、BAGI、RGB12）全面评估环境影响和实际应用可行性。所开发的方法为阿米苏普利德分析提供了一种可持续的生物分析方法，同时满足制药研究和临床实践的严格分析要求。
化学试剂
阿米苏普利德参考标准品（纯度99.23%）和氟哌啶醇内标品（纯度99.58%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。LC-MS级乙腈、甲醇、HPLC级四氢呋喃、丙酮和异丙醇也来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。甲酸（纯度≥98%）和磷酸（85%）由Merck（德国达姆施塔特）提供。分析级醋酸铵、甲酸铵和氢氧化铵（25%溶液）也由Sigma-Aldrich提供。
模型开发与统计分析
SALLE方法的开发遵循了文献中确立的两阶段优化策略[28]。虽然响应面设计理论上可以容纳分类变量（有机溶剂类型和盐析剂类型），但若将5种溶剂类型和2种盐类型作为分类因素，并结合4个连续变量，则需要混合水平或全因子设计，所需的实验次数远超过现有研究中的27次实验。
结论、局限性与未来方向
本研究成功开发并验证了一种用于人血浆中阿米苏普利德定量的新型SALLE-LC-MS/MS方法，解决了现有生物分析方法的局限性，并为可持续分析化学树立了新标准。通过系统的Box-Behnken优化，该方法实现了高提取回收率（97.6%），同时对环境的影响极小，这是该绿色萃取技术首次应用于阿米苏普利德分析。
资助
本研究得到了沙特阿拉伯利雅得Nourah bint Abdulrahman大学研究支持项目（PNURSP2025R466）的支持。
作者贡献声明
艾哈迈德·塞拉格（Ahmed Serag）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、数据管理。
玛娜尔·E·阿洛赛米（Manal E. Alosaimi）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、资金获取、数据分析、数据管理。
马拉姆·H·阿卜杜勒贾巴尔（Maram H Abduljabbar）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。
阿德南·阿尔哈比（Adnan Alharbi）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢沙特阿拉伯利雅得Nourah bint Abdulrahman大学通过Nourah bint Abdulrahman大学研究支持项目（PNURSP2025R466）对本研究的支持。
