利用高效液相色谱-串联质谱联用技术测定人血清中的15种邻苯二甲酸酯代谢物和9种双酚

《Journal of Chromatography A》：Determination of 15 phthalates metabolites and 9 bisphenols in human serum by using high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

本研究建立了基于高效矩阵去除（HMR）和超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）联用技术，同时测定血清中15种邻苯二甲酸酯代谢物和9种双酚类的分析方法。通过系统比较液液萃取（LLE）与HMR清洁法的性能，证实HMR法在萃取效率和基质效应抑制方面更具优势。方法验证显示平均回收率81%-115%，相对标准偏差（RSD）内标法均<18%，检出限（LOD）0.01-0.2 ng/mL，定量限（LOQ）0.04-0.7 ng/mL，日内、日间RSD分别为4.2%-13%和6.9%-14%。该敏感分析方法已成功应用于15名孕妇血清样本的检测，为EDCs的体内暴露评估提供可靠工具。

　　

刘一琳|文娟|张旭|林晓|冯庄庄|鲍德军|胡晓健|朱颖

中国疾病预防控制中心国家环境卫生研究所环境与人群健康重点实验室，北京100021，中国

摘要

内分泌干扰物（EDCs）是一类新兴的污染物，引发了重大的公共卫生问题。人类同时暴露于特定EDCs混合物（如邻苯二甲酸酯和双酚类）及其相关的健康风险仍知之甚少。为了支持对这些化合物的生物监测和流行病学研究，迫切需要开发出灵敏可靠的方法来对其进行定量分析。本文开发并验证了一种基于超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）的分析方法，用于同时测定人血清中的15种邻苯二甲酸酯代谢物和9种双酚类。通过系统比较液-液萃取（LLE）和高效基质去除（HMR）两种净化方法，发现HMR在萃取效率和减少基质效应方面具有优势，最终被选为本研究的最终净化方法。所开发的方法表现出令人满意的结果，回收率在81%到115%之间，相对标准偏差（RSD）低于18%。使用同位素标记的内标建立的校准曲线具有良好的线性，相关系数（R2）始终高于0.997。检测限（LODs）和定量限（LOQs）分别确定为0.01 ng/mL至0.2 ng/mL和0.04 ng/mL至0.7 ng/mL。日内和日间精密度均令人满意，RSD值分别在4.2%到13%和6.9%到14%之间。该方法成功应用于15名孕妇血清样本中目标分析物的测定，证明了其在监测人血清中这些新兴污染物方面的适用性。

引言

近年来，内分泌紊乱的显著增加与环境和食物链中化学污染物的普遍存在密切相关[1]。许多这些化学物质是合成或天然存在的，它们会干扰激素合成，破坏生殖系统的正常生理功能，并干扰精密的内分泌系统[2,3]。因此，这些化合物被归类为内分泌干扰物（EDCs）[4],[5],[6]。由于这些化合物的生产量巨大且在各种消费品中的广泛使用，人们对人类接触EDCs的担忧日益增加。

其中，研究最广泛的内分泌干扰物包括邻苯二甲酸酯和环境酚类，尤其是双酚类。由于这些化合物的生产量巨大且在各种消费品中的广泛应用[7],[8],[9]，它们在现代生活中无处不在。这些化合物主要用作塑料添加剂，以改善原始塑料材料的物理性能和柔韧性[10]。然而，这些化合物通过非共价作用结合到塑料基质中，导致其渗入环境，最终使人暴露于其中[11]。人类接触邻苯二甲酸酯和双酚类的途径多种多样，例如通过受污染的食物和水摄入、吸入空气中的颗粒物以及个人护理和家用产品的皮肤吸收[12]。先前的研究表明，邻苯二甲酸酯和双酚类具有神经毒性、发育毒性和肝毒性等不良影响[13],[14],[15]。流行病学研究进一步表明，接触这些化合物会干扰人体代谢过程，并与儿童、孕妇和老年人群的肥胖、糖尿病和哮喘发病率呈正相关[16,17]。这些健康发现依赖于在生物样本中准确定量这些污染物。

值得注意的是，最近的一项研究表明，在怀孕早期接触EDCs混合物与后代神经发育毒性有关，导致语言发育迟缓。在这些混合物中，邻苯二甲酸酯代谢物和双酚类类似物被认为是主要致病因素。这些发现表明，即使是在怀孕和幼儿期等关键发育阶段，低水平的接触也可能导致显著的健康影响。这也凸显了迫切需要解决子宫内接触这些特定化学物质所带来的健康风险。

通常，通过测量母体生物样本中母体化合物及其代谢物的浓度来评估接触邻苯二甲酸酯和双酚类的情况[18],[19],[20],[21]。也有研究分析了人血清中的邻苯二甲酸酯代谢物和双酚类[22],[23],[24]。然而，大多数现有的分析方法主要针对某一类化合物。虽然已经开发出同时测定多种分析物的替代方法，但提取参数的必要妥协往往会导致特定物质的回收率降低。此外，有效的基质去除预处理方案涉及顺序的液-液萃取和固相萃取（LLE-SPE）过程。这种多步骤程序耗时较长，限制了其在大规模生物监测应用中的适用性。

在这项研究中，我们开发了一种简单灵敏的方法，基于高效基质去除脂质（HMR）净化技术，结合超高效液相色谱和串联质谱（UHPLC-MS/MS），用于测定人血清中的24种EDCs，包括15种邻苯二甲酸酯代谢物和9种双酚类。为此，比较了两种样品预处理方法（液-液萃取（LLE）和HMR净化）。系统评估了所有24种目标分析物的绝对回收率和基质效应。评估了八种不同极性的萃取溶剂在从血清中提取和纯化目标化合物方面的效率。通过三种浓度的加标回收实验验证了定量方法的可靠性。通过日间和日内测量彻底评估了准确性和精密度。最后，将验证的方法成功应用于中国江苏省孕妇血清样本中目标化合物的定量分析。

部分摘录

化学物质和试剂

甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）为HPLC级，购自Merck（德国奥格斯堡）；乙酸购自TEDIA。β-葡萄糖醛酸酶购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。高效基质去除脂质96孔板（20 mg/1.0 mL）试剂盒（HMR试剂盒）购自Anavo Technology（中国）。使用Milli-Q Integral系统（Millipore，美国马萨诸塞州比勒里卡）制备了电阻率为18.2 MΩ cm?1的超纯水。

关于目标化合物，

质谱参数的调整

目标分析物及其相应的同位素内标的单标准品用ACN-水（1:1，v/v）稀释至100 ng/mL。对每种分析物标准品在正离子化（ESI+）和负离子化（ESI-）模式下进行了初始直接注入实验，以评估其相对离子化效率。结果显示，在负离子模式下，两类化合物均显示出更强的信号。

结论

本研究开发了一种分析方法，用于同时定量人血清中的24种EDCs，包括15种邻苯二甲酸酯代谢物和9种双酚类。该方法结合了高通量基质去除净化（HMR-净化）技术和UHPLC-MS/MS，相比现有方法提供了更高效和便捷的工作流程。该方法具有广泛的化合物覆盖范围、高灵敏度、准确性和精密度。验证的性能指标证实了该方法的有效性。

CRediT作者贡献声明

刘一琳：撰写初稿、进行调查和数据采集。文娟：撰写初稿、数据处理。张旭：审稿与编辑、资金获取、概念构思。林晓：数据采集。冯庄庄：图形制作。鲍德军：调查。胡晓健：调查。朱颖：监督

CRediT作者贡献声明

刘一琳：撰写初稿、进行调查。文娟：撰写初稿、资源获取、调查。张旭：撰写、审稿与编辑、方法学设计、概念构思。林晓：调查。冯庄庄：调查。鲍德军：数据可视化。胡晓健：验证、调查。朱颖：监督。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了非传染性疾病-国家科学技术重大项目（2024ZD0531600）的支持。