《Plant Biotechnology Journal》：Engineering Marker-Free Lettuce Chloroplast Genome to Express Functional Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Agonists Exenatide and Lixisenatide
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本研究通过无标记基因的叶绿体工程技术，在可食用生菜中高效表达融合了霍乱毒素B亚基（CTB）的GLP-1受体激动剂（GLP-1RA）Exenatide和Lixisenatide。研究证实了目标蛋白在冻干植物粉末中的高表达（最高达7 mg/g）、功能性五聚体组装、GLP-1受体（GLP-1R）结合活性以及母系遗传稳定性，为开发低成本、可口服的糖尿病/肥胖症治疗药物提供了新途径，有望显著提高药物可及性和患者依从性。
工程化无标记基因生菜叶绿体以表达功能性胰高血糖素样肽-1受体激动剂Exenatide和Lixisenatide
1 引言
糖尿病（Diabetes Mellitus）是一种全球性流行病，影响超过5亿人，每年导致600-700万人死亡。胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1RAs）在2型糖尿病（T2DM）及相关并发症治疗中展现出多重益处，包括葡萄糖依赖性胰岛素分泌、延缓胃排空、降低食欲、减轻体重以及降低糖化血红蛋白（HbA1C）等。然而，化学合成的GLP-1RAs（如Wegovy、Byetta、Adlyxin等）价格昂贵且需注射给药，患者依从性差。口服制剂（如Rybelsus）则存在所需剂量高（每月口服420 mg对比注射10 mg）、胃肠道并发症等问题。因此，开发低成本、可口服的GLP-1RAs具有重要临床意义。植物叶绿体表达系统，特别是可食用生菜（Lactuca sativa），因其能实现生物封装（保护药物免受胃酸和消化酶破坏）、无需纯化和冷链、生产成本低廉等优势，成为生产口服生物制剂的理想平台。本研究旨在利用无标记基因的生菜叶绿体系统表达CTB融合的Exenatide和Lixisenatide，以实现其口服递送。
2 结果
2.1 无标记pLsLF-MF-CTB-Lixi和pLsLF-MF-CTB-Exe叶绿体载体的构建
为在生菜叶绿体中实现高效表达，对Lixisenatide（lixi）编码序列进行密码子优化，将24个密码子（包括4个稀有密码子）替换为叶绿体psbA基因偏好密码子。将优化后的Lixi基因（5‘端含弗林蛋白酶切割位点RRKRSV）克隆至叶绿体转化载体pLsLF-MF的CTB-铰链区下游，构建pLsLF-MF-CTB-Lixi。同样，将已在烟草中高效表达的CTB-Exi基因亚克隆至pLsLF-MF载体中psbA光响应启动子下游，构建pLsLF-MF-CTB-Exe。酶切和测序验证了载体构建的正确性，并在大肠杆菌中证实了CTB-Lixisenatide（~17.67 kDa）和CTB-Exenatide（~16.81 kDa）融合蛋白的表达。
2.2 CTB-Exe和CTB-Lixi生菜转质体株系的获得
通过基因枪法将构建体导入生菜叶绿体基因组。Southern blotting证实了表达盒在叶绿体基因组中的定点整合。在pLsLF-MF-CTB-Exe转化中获得的6个株系中，株系#28为带有标记基因（aadA）的同质体，株系#51为带有/不带有aadA基因的异质体，其他株系主要为未转化基因组。在pLsLF-MF-CTB-Lixi转化中获得的5个阳性株系中，株系#13为带有aadA的同质体，株系#26为带有/不带有aadA的异质体。Western blotting在所有转质体株系中检测到目标蛋白的单体和二聚体形式。
2.3 冻干植物细胞中CTB-Exenatide和CTB-Lixisenatide融合蛋白的表征
温室培养的转质体生菜在不同生长天数（70、85、100、120天）采收叶片并冻干。CTB-Exenatide表达量随生长时间增加，在120天时达到最高1.95 ± 0.01 mg/g干重，表现为~16.81 kDa单体和~33.62 kDa二聚体。GM1结合ELISA实验证实了CTB-Exenatide五聚体的正确组装及其与GM1受体的结合能力（与野生型相比，****p< 0.0001）。CTB-Lixisenatide在126天时表达量最高，达3.64 ± 0.24 mg/g干重，并检测到单体（~17.67 kDa）、二聚体（~35.20 kDa）和三聚体（~52.80 kDa）。GM1结合ELISA同样证实了其功能性五聚体结构。
2.4 无标记pLsLF-MF-CTB-Exe株系的筛选
将异质体株系#51在不含抗生素的培养基上继代培养，以促进标记基因*
