《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：The C-domain of the cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) is responsible for its cardioprotective activity by binding to the KDEL receptor relocated to the plasma membrane under endoplasmic reticulum stress conditions
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CDNF及其C末端域通过激活PI3K/AKT通路减轻心肌缺血再灌注损伤，KDEL受体介导细胞膜转位与结合，N末端域影响内吞过程。
Dahienne Ferreira de Oliveira | Leonardo Maciel | Antonio dos Santos Silva | Keyla Cristiny Da Coutinho | Fernando Lucas Palhano | Marcelo F. Santiago | Debora Foguel
巴西里约热内卢联邦大学Leopoldo de Meis医学生物化学研究所
摘要
脑多巴胺神经营养因子（CDNF）已被证明是一种关键的细胞保护分子，在帕金森病模型中具有明确的神经保护作用，最近还显示出心脏保护特性。在这项研究中，我们探讨了CDNF及其分离出的结构域（CDNF-N和CDNF-C）在缺血/再灌注（I/R）损伤中对分离心肌的保护作用。数据表明，未经处理的动物心脏中梗死面积约为40%，而在存在CDNF或CDNF-C的情况下，梗死面积降至约20%，这表明CDNF-C是CDNF心脏保护活性的主要介质。这种保护作用是通过激活PI3K/AKT信号通路实现的，因为使用PI3K/AKT抑制剂wortmannin可以消除CDNF-C的心脏保护效果。该研究还利用心肌细胞（H9c2细胞、新生儿原代心肌细胞和人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞–hiPSC-dCM）在thapsigargin诱导的内质网（ER）应激条件下，研究了CDNF与KDEL受体（KDEL-R）之间的相互作用。共聚焦显微镜观察发现，在ER应激下，KDEL-R会转移到质膜上，并与全长CDNF和CDNF-C结合。然而，只有全长CDNF会被心肌细胞内吞，这表明N结构域对CDNF的内吞过程至关重要。内吞后，CDNF主要被转运到溶酶体，少量则定位于线粒体和内质网。总体而言，这些发现表明外源性CDNF通过其C结构域作为一种新的心肌细胞因子发挥作用，并通过KDEL-R介导的PI3K/AKT激活途径，在心脏损伤和ER应激相关疾病中具有治疗潜力。
引言
新发现的神经营养因子家族（NFs），包括脑多巴胺神经营养因子（CDNF）和中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子（MANF），因其细胞保护特性而受到越来越多的关注，尤其是在保护神经和心脏组织方面[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]，同时也涉及胰腺β细胞[7]、视网膜细胞[8]以及肝/肾损伤模型[9]。
CDNF和MANF主要定位于内质网（ER）腔内，它们由于具有特定的C端序列（CDNF的KTEL和MANF的RTDL：赖氨酸/精氨酸、苏氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和亮氨酸）而滞留在此处。这些序列使它们能够与KDEL受体（KDEL-R）结合，后者在将蛋白质从高尔基体返回内质网过程中起关键作用[10]、[11]、[13]。在应激条件下，CDNF和MANF会从内质网分泌到细胞外空间，在那里发挥旁分泌和自分泌作用[2]、[6]、[14]。去除ER滞留序列会增强它们的分泌能力：在SH-SY5Y细胞中删除MANF的RTDL会增加分泌[12]，而在上颈神经节神经元中删除CDNF的KDEL会消除抗凋亡作用[15]，并在ARPE-19细胞中促进分泌[16]。然而，调控它们分泌的精确机制仍不完全清楚。
尽管多项研究报道了KDEL-R从高尔基体/内质网转移到质膜的过程[17]、[18]，但其在细胞表面的相互作用伙伴和功能结局仍不清楚。在三种哺乳动物受体亚型中，KDEL-R1似乎在质膜上的表达最为丰富，并被认为可能是伴侣蛋白和生长因子（包括MANF[12]、[19]和CDNF[6]）的潜在受体。
研究表明，CDNF和MANF的保护和修复作用主要通过调节内质网中的未折叠蛋白反应（UPR）来实现，尤其是在钙失衡、缺氧、葡萄糖缺乏、氧化应激、病毒感染、高脂肪或胆固醇水平以及特定蛋白质突变等应激条件下[20]、[21]、[22]。通过减轻过度激活的UPR，抑制PERK–eIF2α–CHOP介导的凋亡并防止线粒体损伤，MANF和CDNF在减少凋亡、维持细胞活力和保持蛋白质稳态方面起着关键作用[6]、[10]。在缺血/再灌注（I/R）模型中，MANF通过调节PERK/eIF2α和ATF6通路，保护蛋白质折叠能力，并激活PI3K/AKT（在某些情况下还包括ERK通路[23]、[24]，从而限制细胞死亡。在帕金森病模型中，CDNF也能通过保护多巴胺能神经元（如6-羟基多巴胺（6-OHDA）和MPTP诱导的模型）来改善神经元存活和运动功能[26]。CDNF还在脑缺血/再灌注（I/R）模型中表现出保护作用，例如在中脑动脉阻塞（MCAO）情况下，它可以减小梗死面积，抑制CHOP的表达，并激活皮质神经元的AKT和ERK信号通路[27]。
CDNF和MANF的三级结构显示两个结构域通过一个连接子相连，并由四个二硫键稳定，其中一个位于较小的C结构域[28]、[29]。多项研究试图确定CDNF和MANF的哪个结构域对其细胞保护活性起主要作用。Graewert等人2024年的研究[30]表明，CDNF的C结构域（CDNF-C）在体内与内质网中的78 kDa葡萄糖调节蛋白（Grp78，HSP5A基因）的核苷酸结合域相互作用，而小角X射线散射（SAXS）和核磁共振（NMR）研究也在体外证实了这种相互作用[30]。
我们团队最近的研究表明，外源性添加的CDNF通过作为心肌细胞因子发挥作用，通过KDEL-R和激活PI3K/AKT通路来预防I/R引起的损伤和ER应激。与含有KDEL样序列的七肽（THPKTEL）或CDNF-ΔKTEL（缺少最后四个残基的CDNF截短版本）联合使用时，保护作用消失，这表明质膜上的KDEL-R可能是其受体。此外，还有其他依赖情境的信号通路（如MAPK/ERK、STAT3和钙稳态）也参与了CDNF的信号传导[2]、[14]、[31]、[32]。
在这里，我们纯化了CDNF的两个结构域，并在受到I/R处理的大鼠心肌中测试了它们的保护作用。只有CDNF-C能够再现全长CDNF的保护效果，主要是通过激活PI3K/AKT通路实现的。使用FITC标记的构建体（CDNFFITC、CDNFFITC-C、CDNFFITC-N和CDNFFITC-ΔKTEL），并通过时间延迟和共聚焦显微镜观察到，CDNF和CDNF-C在TG诱导的ER应激下与H9c2细胞、新生儿心肌细胞和hiPSC-dCM的质膜上的KDEL-R结合。只有全长CDNF被内吞到溶酶体，表明N结构域决定了CDNF–KDEL-R复合物的细胞内转运。CDNF-N表现出非特异性的膜结合，与其sapoin样结构一致。据我们所知，这是首次证明KDEL-R在ER应激的心肌细胞质膜上作为功能性CDNF受体起作用，其结合是由C结构域介导的。
材料
除非另有说明，所有化学品（分析级）均来自Sigma-Aldrich（美国）。所有溶液均为新鲜制备并过滤（0.22 μm，Millipore）。
动物和伦理批准
本研究遵循美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验室动物护理和使用指南》（第8版，2011年）进行，并获得了当地机构动物护理和使用委员会（IACUC，协议154/21）的批准。使用从心脏分离的心肌细胞...
CDNF的C端结构域（CDNF-C）是其心脏保护活性的关键介质
CDNF是一种具有心脏保护作用的蛋白质[6]，由两个明确的结构域组成：N结构域和C结构域[29]。虽然多项研究探讨了哪个结构域负责CDNF作为抗ER应激蛋白的生物活性，但大多数研究集中在其中枢神经系统中的作用[22]、[29]，而其在心脏环境中的功能尚未得到探索。
我们现在拥有了CDNF的N结构和C结构域以及缺少最后四个氨基酸的截短版本CDNF-ΔKTEL（图1A）...
讨论
CDNF是一种具有治疗急性心肌梗死潜力的心肌细胞因子，这一点已由我们团队先前证明[6]。我们的发现表明，其心脏保护活性依赖于C端的KTEL序列，该序列通过与KDEL-R的结合以及激活PI3K/AKT通路来实现。
在这里，我们发现CDNF的N结构域无法保护受到缺血/再灌注（I/R）应激的心脏或经TG处理的心肌细胞。相比之下，单独使用CDNF-C可以再现...
结论
我们的研究提供了强有力的证据，证明CDNF的C端结构域是通过PI3K/AKT通路发挥心脏保护作用的主要介质。我们发现，在ER应激条件下，KDEL-R会转移到质膜上，并与CDNF和CDNF-C结合，激活保护性信号通路。
虽然CDNF-C足以激活AKT并发挥心脏保护作用，但只有全长CDNF会被内吞，这表明其N端结构域在保护过程中起着额外的作用...
CRediT作者贡献声明
Dahienne Ferreira de Oliveira：撰写 – 原稿、方法学、实验设计、数据分析、数据管理。Leonardo Maciel：撰写 – 原稿、可视化、验证、软件应用、实验设计、数据分析、概念化。Antonio dos Santos Silva：方法学、实验设计、数据分析。Keyla Cristiny Da Coutinho：验证、实验设计、数据分析。Fernando Lucas Palhano：撰写 – 审稿与编辑、概念化。
资金来源
本工作得到了巴西资助机构CNPq和Capes以及里约热内卢州资助机构Faperj的支持。
利益冲突声明
作者声明与本文内容没有利益冲突。
致谢
我们感谢Santiago Alonso和Camilla Bayer在Precision Medicine Research Center（CPMP）动物设施中的技术支持，以及Bruna Barreto对大鼠的精心照料。同时感谢心脏电生理实验室在Langendorff实验中的协助。CDNF-C结构域的表达和纯化得益于Marcius da Silva Almeida教授及其研究小组的宝贵支持。
